目的:通过细胞培养及川芎嗪干预，研究川芎嗪(TMP)对体外培养的大鼠外周血的内皮祖细胞(EPC)的增殖和对细胞内内皮性一氧化氮合酶(eNOS)、血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响，探讨川芎嗪对内皮的保护作用。方法:1.采集大鼠外周血，磷酸盐缓冲液(PBS)等比稀释后，将淋巴细胞分离液和稀释血以2:3的比例依次加入离心管中，在水平离心机中以离心力400g，时间20分钟密度梯度离心分离单个核细胞。将分离出的单核细胞洗涤两次后，重悬细胞，调整细胞密度后接种于培养瓶，用10ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)诱导培养。在光学显微镜下观察细胞生长形态，进行表面标记CD133的鉴定和吞噬ac-LDL、IJEA-1的功能鉴定。2.将细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，接种于96孔板中，分为五组:A、B、C、D、E。待细胞贴壁后，分别用含有不同浓度的川芎嗪的培养基(0.3mmol/L，0.6mmol/L，0.9mmol/L,1.2mmol/L)培养B、C、D、E组细胞。A组为对照组，加入不含川芎嗪的培养基。培养24小时后，再用四唑盐(MTT)比色试验，显色后用酶标仪测定490nm波长时各孔OD值。根据OD值比较不同浓度的川芎嗪对细胞增殖的影响，并和对照组相比较。3.将细胞接种于底部铺有盖玻片的6孔板中，待细胞长满50％1I寸，换用含0.6mmol/L川芎嗪的培养基培养24小时，加入用4％多聚甲醛固定细胞，用免疫组化方法检测川芎嗪干预的内皮祖细胞的一氧化氮合酶、血红素加氧酶-1的表达，并与未进行川芎嗪干预的对照组比较。采用计算机图象分析系统，对酶蛋白的表达的强弱进行半定量的检测。应用图象分析软件Image-Pro Plus6.0对染色的细胞图片进行分析，以平均光密度值量化蛋白表达的强弱，以便进行统计分析。4.用SPSS11.0统计软件对各项结果数据进行统计分析，对不同浓度川芎嗪对细胞增殖的影响采用单因素的方差分析，对川芎嗪对细胞eNOS、HO-1表达的影响采用两独立样本均数比较的t检验。结果:1.大鼠每毫升外周血中可分离出1-2×106个单核细胞，将分离出的单核细胞调整接种密度在5×106/mL左右，在含10ng/mL VEGF的培养基中诱导分化培养。接种48小时后，细胞开始贴壁；7天左右，梭形细胞逐渐增多，出现铺路石样生长；生长14天左右，细胞出现集落样生长。细胞表面标记CD133鉴定胞膜层显示绿色荧光，呈阳性。双荧光染色可见细胞胞浆呈红色荧光，胞膜呈黄绿色荧光，将细胞图片叠加可见染色双阳性细胞，证明其能内吞ac-LDL、结合UEA-1，与内皮细胞功能相符。2.酶标仪测定490nm波长时各组OD值，各组OD值均用-X±S表示。用SPSS 11.0软件对各组结果数据进行单因素的方差分析。统计分析结果表明:各组间的F=6.690，P=0.000<0.05，说明各组间方差齐性，五个组间的差别有显著性，进一步用LSD法进行组间的两两比较。A组与B组差别有显著性，B组细胞增殖高于A组(P<0.05)；C组细胞增殖高于A组(P<0.05)；D组细胞增殖高于A组(P<0.05)；E组与A组差别没有显著性(P>0.05)，说明1.2mmol/L的川芎嗪并不能明显促进细胞的增殖；C组细胞增殖高于B组(P<0.05)；C组细胞增殖高于D组(P<0.05)，说明0.9mmol/L的川芎嗪促进细胞增殖的能力不如0.6mmol/L川芎嗪；C组细胞增殖高于E组(P<0.05)。川芎嗪能够提高内皮祖细胞的增殖指数，0-0.6mmol/L川芎嗪浓度是，随着浓度的升高，增殖指数也随之升高；当浓度高于0.6mmol/L时，增殖指数较0.6mmol/L时降低。3.①eNOS在细胞胞浆中表达，免疫组化反应及DAB显色后，在光学显微镜下观察，胞浆中可见棕黄色细小颗粒。对照组细胞胞浆中可见少许棕黄色颗粒，细胞轮廓不清楚；而川芎嗪干预组的细胞可见在细胞核周围的胞浆中可见较多的棕黄色颗粒，整个细胞的轮廓清楚。将图象分析软件Image-Pro Plus6.0对图片分析后的平均光密度值进行统计分析后，对照组与川芎嗪组的光密度值差异有显著性(P<0.05)，因此可以认为川芎嗪组的平均光密度值高于对照组，也就是说川芎嗪组NOS的蛋白的表达高于对照组。②HO-1表达在细胞胞浆中，免疫组化反应及DAB显色后，在光学显微镜下观察，阳性反应在胞浆中可见棕黄色细小颗粒。对照组细胞胞浆中可见少许棕黄色颗粒，细胞轮廓不清楚；而川芎嗪干预组的细胞胞浆中可见较多的棕黄色颗粒。将图象分析软件Image-Pro Plus6.0对图片分析后的平均光密度值进行统计分析后，对照组与川芎嗪组的光密度值差异有显著性(P<0.05)，因此可以认为川芎嗪组的平均光密度值高于对照组，也就是说川芎嗪组HO-1的蛋白的表达高于对照组。结论:1.川芎嗪可以促进内皮祖细胞的增殖，增殖指数呈浓度依赖性。2.川芎嗪可以促进内皮祖细胞内的一氧化氮合酶、血红素加氧酶-1的表达增加。3.川芎嗪可促进内皮祖细胞对损伤动脉内皮的修复，抑制平滑肌细胞增生，促进血管内皮功能恢复。