脑卒中是全球范围内导致死亡的主要疾病,目前已经成为仅次于心脏病和癌症的第三大致死原因。而缺血性中风的发病率约占中风的87%,是脑卒中的主要类型,具有发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高等特点,给患者及其家庭带来了痛苦,也对社会医疗体系造成了沉重的经济负担。缺血性中风引起的脑缺血及继发的再灌注会导致严重的脑损伤。尽快恢复脑损伤后的血液供应,挽救濒临死亡的神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞,是减轻脑缺血后脑损伤的关键。如何诱导血管形成来促进缺血周边血管发生或侧支循环的建立,在已阻塞或狭窄的动脉周围组成内生的旁路循环,实现损伤组织缺血区的自我搭桥,是探求减轻缺血组织损伤、促进功能重建的应予关注之点。我们在前期的一系列实验中发现,电针可以增加脑缺血再灌注损伤后大鼠骨髓和外周血中内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)的数量,增强脑损伤区的血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular endothelial growthFactor receptor2, VEGFR2)的表达。而EPCs与血管形成密切相关,同时能够参与内皮修复;VEGF则是EPCs动员、迁移、归巢过程中最有潜力的因子。这就说明针刺能够刺激机体产生相关的生长因子,并能够上调骨髓与外周血中EPCs的水平,与脑缺血再灌注损伤区的血管形成及内皮修复有关。此外,有研究报道碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)与VEGF在血管新生过程中起着协同作用,且能够促进内皮细胞的增殖、迁移,对神经元也有着积极影响；而CD34作为EPCs的一种表面抗原,也可以用来标记血管密度,以观察组织的血管生成情况。为了进一步研究针刺对脑缺血再灌注区域的EPCs表达及对血管修复情况的影响,我们拟观察针刺后不同时间点脑缺血再灌注损伤区的CD34+、bFGF的表达情况。由于我们前期的实验都属于动物的在体实验,为了更清楚地观察针刺的效果,探索其相关机制,拟通过培养EPCs并采用“针灸血清”对其干预的方式进一步进行研究,以观察针刺对EPCs的增殖、迁移、黏附等能力的影响。通过这一研究,我们将更进一步地探明针刺对脑缺血再灌注区域血管新生的影响及其对EPCs的作用,有可能使我们阐明针刺通过调理气血、疏通经络的作用促进损伤后血管发生的相关机理,对进一步探索针刺的治疗机理研究起到重要作用。实验一电针对脑缺血再灌注大鼠bFGF、CD34表达的影响目的：观察电针及预电针对脑缺血再灌注大鼠缺血大脑皮层bFGF和CD34表达的影响,探讨电针对脑缺血后血管形成的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组、预电针组,后三组制造大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion, MACO)模型。预电针组与电针组取“后三里”和“曲池”穴,分别于MACO造模前、后进行电针治疗。采用免疫组化法观察各组在MACO再灌注后12h、24h、48h三个时间点时缺血大脑皮层bFGF和CD34的表达情况。结果：(1)正常组及假手术组bFGF、CD34阳性表达较少。(2)模型组bFGF阳性表达在脑缺血再灌注后12h处于较低水平,随时间延长呈现上升趋势,24h基本达到峰值,此后又逐渐下降；CD34则由脑缺血再灌注后12h的低值开始,随着时间的延长,呈上升趋势,至48h仍在上升；二者各时间点均与正常组及假手术组有明显差异。(3)电针组bFGF阳性表达在脑缺血再灌注后12h时与模型组无明显差异,此后呈快速上升趋势且在24h、48h时均于模型组有明显差异：CD34阳性表达在12-24h时上升速度明显较模型组为快,而在24-48h时上升速度基本与模型组平行,在12h与模型比较无明显差异,24h、48h则明显较模型组为高,有明显差异；(4)预电针组bFGF呈快速上升趋势且下降速度较缓,各时间点相较于模型组、电针组也均有明显差异;CD34阳性表达呈持续上升趋势,各时间点均与模型组、电针组有明显差异。结论：电针及预电针都能明显提高脑缺血再灌注大鼠缺血大脑皮层bFGF和CD34的表达,能够为血管生成创造有利条件。实验二内皮祖细胞的分离、培养与鉴定目的：探讨Sprague Dawley (SD)大鼠骨髓源性EPCs分离、培养与鉴定的方法。方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1试验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。结果：(1)形态学观察：分离的BMNCs经诱导培养后,在生长的早(第8天左右)、晚期(第15天左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见；(2)摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示第8天、第21天的细胞均为阳性;(3)免疫荧光化学染色：第8天的细胞表达CD133、VEGFR2;(4)管腔形成实验：在Matrigel基质上15h左右能够生成血管样结构。结论：利用密度梯度离心法分离大鼠BMNCs后以EGM-2MV进行诱导培养,可以获得两种不同形态的细胞；经过鉴定证明获得的细胞符合EPCs的特征；本方法能够简单、快速、可靠、大量地获取EPCS。实验三针刺血清对内皮祖细胞增殖、迁移、黏附功能的影响目的：探讨电针血清及预电针血清对体外培养的EPCs增殖、迁移、黏附等功能的影响。方法：实验一中模型组、电针组、预电针组分别于再灌注48h时获取各组血清,同期获取正常组血清。将不同处理组的血清加至体外分离、培养、鉴定过的SD大鼠骨髓来源的EPCs,并设对照组,采用MTT法确定体外干预时合适的血清浓度,再分别采用MTT法、迁移实验、黏附实验观察各组血清对EPCs (?)曾殖、迁移、黏附能力的影响。结果：(1)20%浓度的预电针血清体外培养的EPCs(?)曾殖能力影响最显著；(2)预电针组血清对体外培养的EPCs增殖、迁移、黏附能力影响最显著,与正常红、模型组、电针组比较有显著差异；(3)电针血清可以提高体外培养的EPCs增殖、迁移、黏附能力,其迁移、黏附能力与模型组、正常组比较有显著差异；增殖能力与模型组无明显差异,与正常组比较有显著差异。(4)模型组血清可以提高体外培养的EPCs增殖、迁移、黏附能力,与正常组比较有显著差异;(5)正常组的EPCs增殖、迁移、黏附能力较对照组为高,与对照组相比有明显差结论：电针血清及预电针血清均能明显提高EPCs的增殖、迁移、黏附能力,这可能是电针能促进缺血、损伤后组织修复和血管形成的因素之一,是针灸能够“行气血、通经络”原因之一。