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研究背景：肾癌(Renal Cell Carcinoma, RCC)占人类全部恶性肿瘤的2%-3%,其中最为常见的组织病理类型是肾透明细胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC)占肾癌的80%-90%。肾癌对放化疗均不敏感,缺少有效的系统治疗方法,因此局限性肾癌经外科手术治疗后预后较好,5年生存率能超过70%,然而转移性肾癌的预后很差,5年生存率低于27.1%。目前对于转移性肾癌的诊断仍然依赖影像学检测,缺少能够早期反应肾癌转移的确切的分子生物学标志。因此临床上可能存在一些患者虽然诊断为局限性肾癌,但实际上已经发生了影像学无法检测到的肾癌微转移灶。这部分患者经过原发灶切除手术后可能比较容易出现肿瘤的转移复发。本研究以基因芯片检测原发转移性ccRCC与未转移ccRCC的mRNA表达谱差异,通过生物信息学分析、实时定量RCP验证、电话随访和体内外生物学功能实验等手段探索了可能促进ccRCC转移的分子生物学机制。材料与方法：1、组织样本收集：收集解放军总医院泌尿外科2009至2012年135例肾透明细胞癌组织样本。其中21例患者为原发转移性肾透明细胞癌,114例患者为原发未转移肾透明细胞癌。2、随访观察：对114例原发未转移肾透明细胞癌患者进行了电话随访,观察事件为肿瘤的转移复发。随访时间为14.1至41.5个月,中位随访时间28.2个月,失访患者4例。3、芯片检测：5例原发转移性肾透明细胞癌以及5例原发未转移肾透明细胞癌组织样本,通过总RNA抽提、纯化、质控、逆转、片段化、标记、杂交等步骤,使用Affymetrix Human Genome U133Plus2.0Array检测样本转录谱。经随机方差模型(RVM) t检验筛选组间具有显著性表达差异的基因(p<0.05)。4、生物信息学分析：Gene Ontology (GO), pathway和Signal-net分析转移性肾透明细胞癌的生物学特性,筛选潜在的促进肾透明细胞癌转移的关键基因。5、RNA提取和实时定量PCR:常规提取组织总RNA,反转录为cDNA。实时定量PCR用SYBR Green法比较△CT。6、免疫组化染色：随机挑选10例原发转移性肾癌组织样本以及10例原发未转移肾癌组织样本。经过石蜡包埋,4μ m连续切片,SP法检测FOXO3a蛋白的表达。7、细胞培养：肾癌细胞株A-498,769-P,786-0, Caki-2, Caki-1, ACHN以及SN12-PM6常规培养用于在体以及体外实验。8、质粒构建、siRNA干扰和细胞转染：FOXO3a的表达质粒pCR3.1-FOXO3a以及靶向沉默FOXO3a的siRNA用于瞬时转染肾癌细胞后经流式细胞仪检测细胞凋亡。FOXO3a的表达质粒pIRES2-EGFP-FOXO3a以及靶向沉默FOXO3a的短发夹RNA (shRNA)表达质粒pGFP-V-RS-shFOXO3a用于构建稳定转染的肾癌细胞株,同时稳定转染相应空质粒的细胞株作为对照组,用于其它生物学功能验证实验。9、提取细胞蛋白及western-blot检测蛋白表达：RIPA裂解液提取细胞蛋白,按照常规western-blot操作步骤检测相关蛋白表达。10、流式细胞仪检测细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI双标法检测肾癌细胞凋亡。11、肿瘤细胞的侵袭迁移实验：将稳转细胞株铺在未加基质胶的Transwell小室中检测肿瘤细胞的迁移能力,铺在加有基质胶的Transwell小室中检测肿瘤细胞的侵袭能力。细胞划痕实验用于检测肿瘤细胞的迁移能力。12、裸鼠原位肾肿瘤模型以及转移灶的检测：将构建好的稳转肾癌细胞株用微量注射器种植在裸鼠单侧肾脏皮质内。6周后处死裸鼠,取肺组织切片做HE染色寻找肺转移灶。用IVIS系统检测裸鼠肺组织中绿色荧光的含量从而定量检测肺转移灶的多寡。实验结果：1、经过Affymetrix Human Genome U133Plus2.0芯片检测对比,发现在肾透明细胞癌原发转移组与未转移组之间有1257个基因表达差异具有显著性意义(p<0.05)。对这1257个差异基因进行GO和pathway分析发现这些差异基因具有间质细胞的表达特征,提示在转移性肾癌中可能发生上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。结合Signal-net分析和PubMed数据采集,推测差异基因中FOXO3a的表达下调可能是促进肾癌转移的关键基因。2、经过实时定量PCR检测,对比21例原发性转移组和经过1：2配对的42例原发性未转移组中FOXO3a mRNA的表达。结果表明FOXO3a mRNA水平在原发性转移组中下调,证实了芯片检测的结果。3、免疫组化染色结果表明FOXO3a蛋白表达在ccRCC原发性转移组中也下调。Western-blot检测实验室培养的全部7株肾癌细胞株中FOXO3a蛋白的基础表达量,发现肾癌细胞株786-O的FOXO3a蛋白表达丰度最高,高转移性肾癌细胞株SN12-PM6的FOXO3a蛋白表达丰度最低。4、对114例原发未转移的ccRCC患者进行电话随访和生存分析,发现FOXO3a的mRNA表达下调是ccRCC术后转移复发的独立危险因素。5、流式细胞仪检测结果表明FOXO3a能促进786-O和SN12-PM6细胞的凋亡。6、Transwell实验结果表明,稳定敲低FOXO3a的786-O细胞侵袭迁移能力增加,然而稳定过表达FOXO3a的SN12-PM6细胞的侵袭迁移能力降低。采用细胞划痕实验测定肿瘤细胞的迁移能力改变得到了相同的结果。7、裸鼠原位肾肿瘤模型实验结果表明,原位种植稳定过表达FOXO3a的SN12-PM6细胞株与原位种植稳定转染空质粒的SN12-PM6细胞株相比,其肺部转移灶的形成显著减少。8、在786-O细胞中沉默FOXO3a能促进SNAIL1基因的表达上调,从而诱导细胞发生EMT,促进肿瘤细胞侵袭迁移。结论：本研究发现在原发转移性肾透明细胞癌中FOXO3a基因表达下表,并且在未转移肾透明细胞癌中FOXO3a(?)氐表达是术后发生转移复发的独立危险因素。FOXO3a的下调可能通过促进SNAIL1基因的表达诱导肿瘤细胞发生EMT转化,从而促进肾透明细胞癌发生远处转移。