【摘 要】
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牛肺表面活性蛋白A（surfactant protein A,SP-A）是一种重要的凝集素蛋白,在肺脏防御病原体的入侵方面起到了重要作用。A型多杀性巴氏杆菌是引起牛呼吸系统疾病的重要病原菌之一,给全球养牛业造成了巨大的经济损失。国内学者报道天然牛SP-A蛋白对致病性大肠杆菌等病原菌有抑制作用,为了探究重组牛SP-A蛋白是否对牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）有抑制
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“肺表面活性蛋白A在牛多杀性巴氏杆菌感染中的作用及研究机制”（项目编号:32102678）
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牛肺表面活性蛋白A（surfactant protein A,SP-A）是一种重要的凝集素蛋白,在肺脏防御病原体的入侵方面起到了重要作用。A型多杀性巴氏杆菌是引起牛呼吸系统疾病的重要病原菌之一,给全球养牛业造成了巨大的经济损失。国内学者报道天然牛SP-A蛋白对致病性大肠杆菌等病原菌有抑制作用,为了探究重组牛SP-A蛋白是否对牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）有抑制作用,本文根据Gen Bank中牛SP-A蛋白的氨基酸序列,分析牛SP-A蛋白的基本理化性质,构建原核表达质粒并纯化出重组牛SP-A蛋白,并验证了重组牛SP-A蛋白具有凝集活性以及对Pm具有一定的抑菌活性,获得了少量的天然牛SP-A蛋白。1.牛肺表面活性蛋白A的理化性质分析及重组蛋白原核表达条件摸索根据牛肺表面活性蛋白A登录号（XP＿005909226.1）,利用生物信息学软件分析,发现牛SP-A为分泌性蛋白,具有较强的亲水性,等电点为4.88、大小为25.54 k Da。将牛SP-A蛋白的编码基因按照大肠杆菌密码子优化后合成至p ET28a质粒中,但该载体无法实现目的蛋白的表达;后构建了p Cold-BSP-A-FSH、p Cold-GST-BSP-A-FSH、p Cold-SUMO-BSP-A-FSH和p Cold-TF-BSP-A-FSH表达质粒,摸索表达条件后发现只有p Cold-TF-BSP-A-FSH表达质粒在16℃、0.8 mmol/L的IPTG条件下,实现了TF-BSP-A-FSH重组蛋白在上清中大量表达。2.重组牛SP-A蛋白的纯化及活性探究大量表达TF-BSP-A-FSH重组蛋白,采用Ni-NTA树脂纯化出74 k Da的TF-BSP-A-FSH重组蛋白。利用凝血素酶切割重组蛋白,发现凝血素酶在28℃、酶切9 h效率较高,对目的蛋白的非特异性切割较低。采用Strep-Taction树脂纯化得到26 k Da的BSP-A-FSH重组蛋白。虎红平板凝集方法检测出BSP-A-FSH重组蛋白和TF-BSP-A-FSH重组蛋白具有凝集活性;体外抑菌试验表明重组TF-BSP-A-FSH蛋白对牛Pm的抑菌效果明显,而重组BSP-A-FSH蛋白对牛Pm的抑菌效果极显著;去除内毒素的重组牛SP-A蛋白能增强牛巨噬细胞对牛Pm的吞噬能力,表明纯化的重组牛SP-A蛋白对牛Pm有抑菌活性。3.牛天然SP-A蛋白的提取将纯化的重组TF-BSP-A-FSH蛋白及纯化的重组BSP-A-FSH蛋白分别与弗氏佐剂乳化后,免疫昆明小鼠后获得免疫血清,经WB发现免疫血清检测重组TF-BSP-A-FSH蛋白及BSP-A-FSH重组蛋白具有较好的反应原性,表明成功制备出牛SP-A多克隆抗体。采用麦芽糖-Sepharose（MS）胶粒从牛肺泡灌洗液中粗提取出牛天然SP-A蛋白,经免疫血清检测出天然SP-A蛋白的大小为30 k Da,为下一步牛SP-A蛋白的功能研究奠定基础。本研究成功采用原核表达系统成功表达并纯化出重组牛SP-A蛋白,并发现该蛋白对牛Pm具有抑菌活性,制备出牛SP-A多克隆抗体,为进一步研究牛SP-A蛋白的功能奠定基础。
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