【摘 要】
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自然界中,许多生物均存在生物节律,这是这些生物在逐渐适应地球24小时昼夜交替环境的过程中演化形成的。每种生物体内均存在内在的“生物时钟”。哺乳动物中,这种内在的“生物时钟”的核心主要位于大脑的视交叉上核（SCN）,其主要分子机制为转录翻译反馈回路（TTFL）。CLOCK、BMAL1分别是由Clock、Bmal1基因转录翻译,在细胞质组装形成异二聚体,结合到启动子附近的E-box来驱动其他生物钟基因
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自然界中,许多生物均存在生物节律,这是这些生物在逐渐适应地球24小时昼夜交替环境的过程中演化形成的。每种生物体内均存在内在的“生物时钟”。哺乳动物中,这种内在的“生物时钟”的核心主要位于大脑的视交叉上核（SCN）,其主要分子机制为转录翻译反馈回路（TTFL）。CLOCK、BMAL1分别是由Clock、Bmal1基因转录翻译,在细胞质组装形成异二聚体,结合到启动子附近的E-box来驱动其他生物钟基因的转录,如Period（Per1、2、3）和Cryptochrome（Cry1、2）,Rev-erb、Ror、Dbp、Tef、Hlf、E4bp4和钟控制基因（CCGs）。表达的PER和CRY蛋白在胞质中逐渐积累并进行二聚化,在CK1ε/δ介导的磷酸化时,一部分被转移到细胞核内,另一部分被26S蛋白酶体降解。进入细胞核的PER-CRY复合物,与CLOCK:BMAL1结合进而抑制CLOCK:BMAL1的转录活性,间接的抑制了他们自身的表达水平。本实验室构建的Bmal1基因Loop区突变的基因编辑NIH 3T3 B1-B10 G5细胞株,在其Bmal1基因的第13个外显子的第156位至168位,由CCACAACCAGCGA序列编辑为TCGC序列,进而引发细胞生物钟和细胞周期的变化。首先针对BMAL1蛋白突变前后的氨基酸进行性质的比较分析,其次通过以下几种方法检测细胞表型的改变,主要包括:1、使用细胞计数法,来测定细胞增殖能力;2、分别使用细胞划线法和追踪单细胞运动以检测细胞迁移;2、使用LumiCycle细胞节律仪检测细胞生物节律基因的震荡;3、通过流式细胞仪分析细胞周期;4、通过中性红染色分析溶酶体在细胞内的性质的改变;5、检测细胞核心生物钟基因的转录水平;6、通过双荧光素酶报告基因实验测定Loop区突变的BMAL1与CLOCK的形成异二聚体的能力变化等。通过以上实验内容初步了解Bmal1基因Loop区突变对生物钟和细胞周期。我们的结果表明Bmal1基因Loop区突变对细胞表型的改变,主要包括:1、改变了细胞的形态,使细胞形态偏大36.09±17.14μm2;2、显著降低了细胞的增殖速率;3、改变了细胞内溶酶体的性质,包括溶酶体的分布位置、分布集中度、数量或溶酶体内的酸碱度等性质综合作用的结果;4、降低了细胞迁移活动,但并没有完全抑制细胞的迁移;5、改变了细胞周期的分布,使细胞更加集中在G2/M期;6、改变了细胞内节律基因表达,包括降低节律基因表达的振幅、使细胞节律基因表达周期缩短等;7、改变了细胞生物节律基因的转录水平的震荡趋势和震荡水平;8、验证Bmal1基因Loop区不是BMAL1蛋白与CLOCK蛋白之间结合能力的关键影响因素。通过以上实验结果,我们对该Loop区突变对BMAL1蛋白质的功能以及其在细胞内的引发的影响有了初步的认识,进一步深化了对BMAL1蛋白bHLH与PAS结构域之间柔性Loop区功能的认识,提示该Loop区可能对于BMAL1的生物钟功能和其参与其他细胞生理活动具有重要作用。未来我们将对该Loop区是如何影响生物钟和细胞周期展开研究。
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