论文部分内容阅读
目的:本课题组前期研究发现EZH2可促进卵巢癌的腹腔种植,但机制不明。本研究旨在探究卵巢癌细胞中高表达的EZH2抗失巢凋亡的作用。材料和方法:1.建立失巢凋亡模型:用poly-HEMA包被的培养板建立卵巢癌细胞SKOV3和A2780的失巢凋亡模型,观察悬浮培养的卵巢癌细胞SKOV3和A2780的形态变化;2.卵巢癌失巢凋亡模型的鉴定:Annexin V-FITC/PI检测悬浮培养不同时间点(0h/12h/24h/48h/72h/96h)的卵巢癌细胞SKOV3及A2780的凋亡改变;3.卵巢癌细胞失巢状态下生物学特性的变化:分别通过划痕愈合实验、Transwell迁移实验和EDU实验检测SKOV3和A2780细胞悬浮培养48h后迁移能力和增殖能力的变化;4.卵巢癌细胞失巢状态下EZH2表达的变化:Western-blot技术检测卵巢癌细胞SKOV3和A2780悬浮培养不同时间点(0H/12H/24H/48H/72H/96H)的EZH2表达水平;5.慢病毒转染下调EZH2后对失巢凋亡的影响:利用慢病毒转染EZH2短发夹RNA(sh RNA)沉默EZH2的表达,用嘌呤霉素筛选单克隆抗体,建立EZH2低表达的SKOV3稳转株(SKOV3 sh EZH2)和其相对应的对照空载体细胞(SKOV3 sh NC),用western-blot检测SKOV3的转染效率;SKOV3稳定转染株SKOV3 sh EZH2及其对照组SKOV3 sh NC悬浮培养48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较其凋亡率的变化;6.药物对失巢凋亡的影响:用特异性EZH2抑制剂Dznep、GSK126作用于卵巢癌细胞SKOV3,DMSO为对照,流式细胞仪检测悬浮培养48h后不同处理组的卵巢癌细胞的凋亡率;7.动物实验检验EZH2对凋亡的影响:取本实验组前期建立的SKOV3 sh EZH2和SKOV3 sh NC裸鼠腹腔种植瘤模型的瘤体标本切片后TUNEL法检测凋亡的表达;免疫组化检测各标本中EZH2,Ki67,cleaved-caspase-3的表达。结果:1.SKOV3细胞贴壁生长呈不规则多角形,A2780细胞呈长梭形。悬浮培养后SKOV3和A2780细胞的形态学发生明显改变,细胞体积变小,回缩为球形,48h后SKOV3可形成大而疏散的细胞团,而A2780细胞则形成小而致密的细胞球。2.流式细胞仪检测卵巢癌细胞SKOV3在悬浮培养48h后细胞凋亡进入稳态,而A2780细胞的凋亡率呈时间依赖性增高。3.与贴壁细胞相比悬浮培养48h后重贴壁SKOV3和A2780细胞的增殖能力未见明显改变(P>0.05,差异无统计学意义);SKOV3迁移能力明显增强(P<0.05,有统计学差异),而A2780细胞迁移能力未见明显变化(P>0.05,差异无统计学意义);4.Western-blot结果显示:卵巢癌细胞SKOV3随悬浮培养时间的增加EZH2蛋白表达水平逐渐降低,至48h后EZH2的表达趋于稳定,而卵巢癌细胞A2780随悬浮培养时间的延长,EZH2的表达水平未见明显改变;5.SKOV3细胞悬浮培养48h后,与对照组DMSO相比,EZH2抑制剂DZNEP(1μg/ml)和GSK126(1μg/ml)处理组细胞凋亡增多;同时SKOV3 sh EZH2在悬浮培养48h后的凋亡与对照组SKOV3 sh NC相比明显增高;6.裸鼠腹腔种植后瘤体免疫组化及TUNEL实验结果显示:与SKOV3 sh NC组相比,SKOV3 sh EZH2腹腔种植瘤组织中TUNEL表达增强,EZH2,Ki67表达降低,cleaved-caspase-3的表达增强。结论:EZH2可增强卵巢癌的失巢凋亡抵抗能力,这可能是EZH2促进卵巢癌发生转移的重要机制之一。