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奶牛乳腺炎是我国奶牛养殖业的一种常见疾病,其中受到大肠杆菌(E.coli)感染而引起的奶牛乳腺炎占很大比例。大肠杆菌性奶牛乳腺炎的主要致病原理是奶牛乳腺受到损伤后,被E.coli感染入侵,导致奶牛乳腺细胞分泌过量的细胞外基质(ECM),继而造成乳腺的持续性纤维化,病情发展到后期,奶牛乳腺还会发生硬化。本文的实验主要通过深入研究E.coli对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFBs)的MMPs、TIMPs以及uPA系统表达的影响,进一步阐明MMPs、TIMPs以及uPA系统在调控ECM代谢中所起的作用。本实验取已患有乳腺炎的奶牛乳腺,从中分离出致病的病原菌E.coli,并制成不同浓度的热灭活菌液,设计菌液浓度分别为105 cfu/mL、106 cfu/mL、108 cfu/mL,让不同浓度的热灭活E.coli作用BMFB,在作用6 h、12 h、24 h、48 h时分别对BMFB中分泌的MMPs(包括MMP-1/MMP-2/MMP-3/MMP-9/MMP-13)、TIMPs(包括TIMP-1/TIMP-2)以及uPA系统(包括uPA/uPAR/PAI-1)进行检测,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)来检测其mRNA的转录水平的表达,Western-blot技术来检测其蛋白水平的表达。结果显示:(1)不同浓度的热灭活E.coli作用BMFB后,BMFB在各时间点分泌的几种MMPs(MMP-1/MMP-2/MMP-3/MMP-9/MMP-13)的 mRNA 转录水平与对照组相比主要呈升高趋势;其蛋白水平表达不相一致,其中MMP-1的蛋白水平与对照组相比表达除105 cfu/mL处理组在作用6 h显著上升,其余组表达主要呈下降趋势,MMP-2的蛋白水平与对照组相比表达主要呈先下降后升高的趋势,MMP-3/MMP-9/MMP-13的蛋白水平与对照组相比表达主要呈先下降后升高的趋势。(2)不同浓度的热灭活E.coli作用BMFB后,BMFB在各时间点分泌的TIMP-1/TIMP-2的mRNA转录水平与对照组相比主要呈升高趋势;其蛋白水平表达不相一致,其中TIMP-1的蛋白水平与对照组相比105 cfu/mL处理组表达多为下调,其余浓度处理组在作用6 h、24 h表达下调,在作用12 h和48 h表达上调,TIMP-2的蛋白表达水平与对照组相比除108cfu/mL处理组在作用24 h表达上调,其余均为下调。(3)不同浓度的热灭活E.coli作用BMFB后,BMFB在各时间点分泌的uPA/uPAR/PAI-1的mRNA转录水平主要呈升高趋势;其蛋白水平表达不相一致,其中uPA的蛋白表达主要呈先降低后增高的趋势,uPAR的蛋白表达主要呈先升高后降低的趋势,PAI-1的蛋白水平在作用24 h与对照组相比表达显著上调,在作用其余时间点均表达下调。研究表明,热灭活的E.coli菌液诱导BMFB的MMP-1/MMP-2/MMP-3/MMP-9/MMP-13、TIMP-1/TIMP-2和uPA/uPAR/PAI-1的表达,并具有一定的时效和量效关系,提示了 MMPs、TIMPs和uPA系统参与奶牛乳腺的纤维化,uPA系统被激活调控了 MMPs/TIMPs的表达,进而参与降解ECM来影响奶牛乳腺纤维化过程,并可能对E.coli作用BMFB后分泌的ECM进行了调控,为MMPs、TIMPs和uPA系统成为治疗奶牛乳腺纤维化的靶点提供了一定依据。