不同的pH敏感高分子均有一个临界相分离pH值(Critical phase separationpH point,简称CPP),在此pH值附近高分子发生溶解及沉淀的两相转化。本论文以壳聚糖这种天然pH敏感高分子为原料,通过过氧化氢氧化降解法改变壳聚糖的分子量,以及采用偶联精氨酸的化学修饰方法对壳聚糖骨架进行一定的修饰,使其pH敏感点发生相应的变化,得到更接近于中性的临界相转变pH值,更加适应生物分析的环境条件;研究了壳聚糖修饰、壳聚糖与蛋白质及酶之间的共价偶联、静电组装以及金属离子鳌合偶联等方法,并将所制得的偶联物应用于蛋白酶抑制剂的捕获与纯化、蛋白质酶解,以及对蛋白酶的敏感性测定研究中。本论文共分五章。第一章分别介绍了pH敏感性高分子材料,通过改变高分子分子量和骨架结构达到改变pH敏感点的目的,以及修饰过的pH敏感性高分子与生物活性物质的偶联方法等。第二章用过氧化氢降解法制备不同分子量的壳聚糖,考察分子量对pH敏感点的影响。实验结果表明,壳聚糖的分子量越小,其pH敏感点越高,从高分子量壳聚糖到低分子量壳聚糖,大致提高了0.2个pH单位,在沉淀-溶解一次循环后,临界相分离pH值也有相应的提高,近0.02个单位。第三章以EDC/NHS为偶联试剂,将精氨酸偶联到壳聚糖上,考察改变壳聚糖分子骨架对其pH敏感点的影响。实验结果表明,在pH=4-6的MES缓冲溶液中,EDC/NHS与精氨酸摩尔比大于1时,偶联效果较好。适当的增加反应浓度可提高偶联效果。壳聚糖经精氨酸修饰后CPP明显提高,与未修饰前的壳聚糖相比,CPP值提高了近乎1.2个pH单位,更能适应生物分析与分离。第四章探讨了生物活性分子与修饰过的壳聚糖偶联方法,比较了几种方法的偶联效率。其中,共价偶联的方法能将胰蛋白酶有效地偶联到壳聚糖分子上,保留了CS的pH敏感相分离特性及Trypsin的酶催化活性,偶联物在存放30天后可保留69%的初始活性。偶联物经过6次循环使用后的残余活性为初始活性的79%。以静电方式结合的壳聚糖与BSA,在pH=6.0的时候,就能达到很好的偶联效果。用配位方式结合的壳聚糖金属离子与胰蛋白酶,只能保持10%左右的活性,偶联效果不甚理想。第五章探讨了胰蛋白酶-壳聚糖偶联物对胰蛋白酶抑制剂及底物BAPAN的催化活性影响,以及Arg-CS-BSA静电组装复合物对胰蛋白酶的水解效率。其中,Trypsin与CS偶联物同时具备了酶催化活性和pH敏感的相分离特性,使之兼具均相酶催化的高效特性及固定化酶的的高稳定性和重复使用性,在低于临界相转变pH值下进行高效的均相酶解反应,并在高于临界相转变pH值下将Trypsin-CS进行沉淀分离及重复使用,利用复合物的溶解—沉淀可逆特性,可实现均相生物催化反应、选择性识别与结合,及异相分离。该偶联物能有效捕获酶抑制剂,起到分离纯化的作用。作为蛋白质降解试剂则可有效消除胰蛋白酶均相催化时自身酶解产生的肽段对目标蛋白肽谱分析的干扰。此外,Arg-CS-BSA复合物对胰蛋白酶有响应,酶的活性越大,复合物粒子消失速度越快,因此可以直观通过浊度法来测定试样中胰蛋白酶的活性,从而提供一种新的蛋白酶活性测定方法。