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丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类古老的抑制剂,广泛分布于动物、植物、原核生物中,它主要通过调节蛋白酶的活性来调控生物体内许多重要的生命过程,如补体激活、炎症反应、细胞程序性死亡、生长发育、细胞分化和凋亡、蛋白质折叠等。丝氨酸蛋白酶抑制剂在昆虫的免疫应答中发挥着重要的作用,它通过调控先天免疫中的黑化反应、Toll信号通路和Imd信号通路来抵御外来病原物的入侵。为了研究小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能,本文以果蝇的serpin-27A、烟草天蛾的serpin-3和serpin-6的蛋白序列为参考序列,与小菜蛾基因组数据库进行Blast比对,鉴定出可能参与小菜蛾先天免疫的两个基因serpin-3和serpin-6。进一步对这两个基因的编码区进行克隆和表达,并采用RNA干扰、酚氧化酶(phenoloxidase,PO)抑制活力测定等方法鉴定其功能。主要研究结果如下:1.从小菜蛾基因组中克隆出serpin-3和serpin-6的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列。通过序列分析可知:serpin-3的ORF为1353 bp,共编码451个氨基酸,serpin-6的开放阅读框为1242 bp,共编码414个氨基酸。将serpin-3和serpin-6的编码区氨基酸序列与其他昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行序列比对并构建系统进化由序列比对结果可知,小菜蛾serpin-3的靶酶结合位点与烟草天蛾serpin-3、亚洲玉米螟serpin-3的靶酶结合位点完全相同,小菜蛾serpin-6与烟草天蛾serpin-6具有共同的靶酶结合位点。系统发育分析发现发现小菜蛾serpin-3与亚洲玉米螺serpin-3、烟草天蛾serpin-3组成一个姐妹群,小菜蛾serpin-6与烟草天蛾serpin-5共同组成一个姐妹群。2.运用qRT-PCR方法检测serpin-3和serpin-6在小菜蛾各个龄期的表达情况,结果发现serpin-3在成虫时期的表达最高,serpin-6在卵和蛹中高表达。为了分析serpin-3和serpin-6是否参与小菜蛾的先天免疫,选取小菜蛾四龄初期幼虫注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),Oh、3 h、6h、9h、12h后收集小菜蛾样品,用qRT-PCR方法进行检测。结果发现:serpin-3和serpin-6对微生物出现了不同的响应模式,在注射3 h后serpin-3的表达出现了峰值,在注射12h后,serpin-6的表达出现了峰值。serpin-3对革兰氏阴性菌大肠杆菌的反应比较强烈,serpin-6对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的响应更早。3.为了进一步检测serpin-3和serpin-6是否参与小菜蛾的黑化反应、Toll信号通路以及Imd信号通路,利用制备的dsRNA对serpin-3和serpin-6进行RNA干扰,6h、12h、24 h、36h后收集小菜蛾样品,并用qRT-PCR方法进行检测。结果发现:在干扰6 h后,serpin-3的表达显著下降。在干扰24 h后,serpin-6的表达显著下降。在对serpin-3干扰6h后,参与黑化反应的一些基因PAP-1、PAP-3a、PAP-3b、PPO-2的表达没有显著的变化,PPO-1的表达下调。一些抗菌肽基因如Lysozyme表达下调,Gloverin-1和Gloverin-2的表达明显上调,另一些抗菌肽基因如Moricin、Cecropin、的表达没有显著的变化。Toll通路中的Dorsal和Spaetzle-4的表达也出现了上调,然而Imd途径中的FADD的表达明显下调。serpin-6干扰24 h后,参与黑化反应的PAP-1和PPO-2的表达下调,而PAP-3a、PAP-3b、PPO-1的表达与对照组相比没有发生显著的变化。抗菌肽Gloverin-1和Cecropin的表达显著上调,Gloverin-2的表达下调,Lysozyme和Moricin的表达并没有发生变化。Toll通路途径中的To//9和Dorsal的表达明显下降,而Spaetzle-4的表达升高。在Imd途径中,FADD和IKK-r的表达上调。4.将serpin-3和sepin-6的成熟肽序列与表达载体pET-28b连接并转入大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)中诱导表达,两个重组蛋白大小均在50kDa左右。将获得的重组蛋白用镍柱进行纯化并制备多克隆抗体,Western Blot检测出小菜蛾体内有serpin-3和serpin-6存在。圆二色谱光谱分析发现,serpin-3主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规则卷曲组成。其中α-螺旋占39.1%、β-折叠占14.6%、β-转角占16.1%,负峰出现在200nm处。serpin-6主要由α-螺旋组成,其占比已经达到99%、β-折叠仅占0.3%、β-转角占2.7%,它有两个负峰分别在208 nm和222 nm处。PO活力分析验证表明serpin-3和serpin-6能够有效抑制小菜蛾血淋巴的黑化反应。综合上述实验结果表明,serpin-3和serpin-6能够响应病原微生物的侵染,调控黑化反应以及Toll和Imd信号通路,在小菜蛾先天免疫中起着重要的作用。