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巴尔通体(Bartonella)是革兰氏阴性的兼性厌氧小杆菌,主要寄生在人类和宿主的红细胞和血管内皮细胞内,导致感染宿主出现杆菌性血管瘤疾病的发生。巴尔通体营养需求苛刻,遗传操作困难。本研究以特利波契巴尔通体(Bartonella tribocorum,Btr)为研究对象,构建Ⅳ型分泌系统核心基因VirB4的敲除菌株,探索VirB4基因在特利波契巴尔通体感染过程中的作用。一、特利波契巴尔通体VirB4基因的敲除菌株构建首先扩增并融合VirB4基因上下游片段,将片段导入PJM05质粒建立VirB4敲除质粒,将之转化到S17-1中,通过S17-1与Btr的接合转移作用,将PJM05质粒导入到Btr基因组中,再根据SacB基因的蔗糖筛选功能、菌落PCR及片段测序,结果显示22个双交换菌株筛选出6个VirB4基因框内缺失菌株、全长为2355bp的VirB4基因缺失了2136bp,且无移码突变。二、VirB4基因的功能研究本实验对野生型与VirB4缺失型菌株做对比试验,研究其在巨噬细胞内存活、入侵淋巴循环及在Hela细胞感染力的区别。分别用野生型与VirB4缺失型菌株感染大鼠腹腔巨噬细胞30min,通过洗掉胞外菌、庆大霉素杀菌和低温反复冻融的方法释放胞内菌,对胞内菌涂板计数。结果显示野生型与VirB4缺失型菌株均能在巨噬细胞内存活12h。VirB4缺失型菌株在感染早期更容易被巨噬细胞吞噬,但是在12h之内两者的存活率无显著性差异。证明VirB4基因不是特利波契巴尔通体在巨噬细胞内存活的关键因子。基于大鼠胸导管引流模型,用野生型与VirB4缺失型菌株分别感染大鼠,在不同的时间点收集淋巴液,用Taqman探针检测淋巴液中的菌载量。结果显示,不同的时间点野生型与VirB4缺失型菌株均能够进入淋巴循环,但在感染8h后,淋巴循环中的VirB4缺失菌显著增多。证明VirB4基因不决定特利波契巴尔通体侵犯淋巴循环的能力。用野生型与VirB4缺失型菌株感染Hela细胞12小时,庆大霉素杀灭胞外菌,再对Hela细胞染色。结果证实野生型菌株更高效的感染Hela细胞,但并无显著性统计差异。证明VirB4基因并不直接参与特利波契巴尔通体Hela细胞的内吞感染。通过上述三个功能实验的研究,表明VirB4基因在特利波契巴尔通体早期感染中没有发挥关键性作用。