甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)滥用在我国乃至世界范围内增长迅猛。.相比于海洛因、可卡因等传统毒品,MA的成瘾性更强、中枢神经系统损害更严重,但对MA成瘾的研究较为滞后,国内外尚无批准的治疗药物。药物成瘾是从偶然用药、规律性用药转变为强迫性用药的连续过程,其中强迫性用药是成瘾的核心特征。目前研究认为这一转换的行为学基础是由目标导向性逐渐向习惯化过渡,涉及到的核团主要是.以伏隔核(nucleus accumbens,NAc)为核心的腹侧纹状体(ventral striatum,vStr)对行为的控制逐渐让位于背侧纹状体(dorsalstriatum,dStr)特别是背外侧纹状体(dorsolateralstriatum,dlStr),然而其中的细胞分子基础尚不清楚。因此,研究规律性用药转化为强迫性用药的细胞及分子机制是阐明MA成瘾机制的关键。.微小RNA(microRNA,miRNA)是一类在转录后水平调控基因表达的非编码RNA。研究表明miRNA表达异常与可卡因、阿片和酒精成瘾有关,但关于miRNA与MA成瘾的报道较少,尤其是与强迫性用药相关的研究基本处于空白。本课题组前期通过miRNA芯片筛选和验证,在MA强迫性用药大鼠的dStr中发现miR-30a表达显著下调、miR-134表达显著上调,但尚未做分子调控机制的相关研究。一、研究目的本课题旨在前期基础上,研究miR-30a、miR-134是否调控MA强迫性用药行为及其分子机制,为阐明MA成瘾的神经生物学机制提供实验依据。二、研究方法和研究结果(一)dIStr的miR-30a对MA成瘾行为的调节作用1、dlStrmiR-30a与MA强迫性用药行为的相关性(1)具有规律性用药和强迫性用药特征的大鼠MA自身给药模型的建立建立具有“成瘾特征”的实验动物模型,对于揭示MA成瘾的神经机制具有重要的意义。参照文献我们分别建立了具有规律性用药和强迫性用药特征的大鼠MA自身给药模型。结果显示,每天训练6 h的长时程MA自身给药组大鼠(6 h/d,LgA组)的用药次数呈累进式增加,而每天训练2h的短时程自身给药大鼠(2h/d,ShA组)的用药次数始终维持较低、稳定的水平,LgA组总MA摄入量显著高于ShA组;且LgA组前2h的用药曲线及累计MA摄入量也显著高于ShA组。以上结果提示,ShA组大鼠形成稳定、可控的规律性用药行为,而LgA组大鼠形成过度、不可控的强迫性用药行为。本文后续的研究均采用此动物模型。(2)MA主动给药和被动给药模型下大鼠纹状体亚区miR-30a的表达变化规律RT-qPCR实验结果显示,在MA自身给药模型下,与盐水对照组(Con组)相比,ShA组大鼠NAc中miR-30a表达显著下调,而LgA组大鼠dlStr和dmStr中miR-30a表达显著下调,且dlStr的miR-30a表达下调幅度(30%)大于dmStr(15%)。在MA被动给药模型中,低剂量(1mg/kg)短期(7天)的MA暴露引起NAc内miR-30a水平降低,而高剂量(5 mg/kg)长期(28天)MA暴露导致dlStr内miR-30a表达下调。以上结果提示MA规律性用药转变为强迫性用药时,miR-30a的表达下调由NAc扩展至dlStr,此转换由长时间过量的药物暴露介导。(3)上调dlStr内miR-30a对大鼠MA强迫性用药行为的影响我们采用pre-miR-30a来上调miR-30a水平。将携带pre-miR-30的慢病毒(LV-miR-30a)微注射至大鼠dlStr中,与阴性对照病毒(LV-Con)相比,LV-miR-30a能选择性上调dlStr内miR-30a水平;免疫荧光检测显示LV-miR-30a主要定位于神经元中。MA 自身给药行为学结果显示,与双侧dlStr微注射LV-Con相比,LV-miR-30a在上调dlStr miR-30a表达水平的同时,能降低长时程用药模式下MA诱发的大鼠递增性用药曲线及总药物摄入量,提示dlStr miR-30a负性调控大鼠MA强迫性用药行为。2、miR-30a参与MA强迫性用药的神经生物学机制研究(1)MA强迫性用药诱导miR-30a靶分子的差异表达特征我们对miR-30a预测靶分子的生物信息学分析显示,miR-30a预测靶分子的功能主要聚类在基因表达沉默、突触可塑性调节等方面,因此选择介导基因表达沉默的重要分子Tnrc6a及突触可塑性调节的重要分子BDNF进行后续研究(本课题实验及文献工作证实了 BDNF和Tnrc6a是miR-30a直接结合的靶分子)。在MA自身给药大鼠的dlStr亚区中,与Con组相比,LgA组BDNF及Tnrc6a表达显著升高,而ShA组则无显著改变。在dmStr亚区,三组大鼠的BDNF、Tnrc6a表达水平均无显著差异。因此,MA强迫性用药特异性上调dlStr内BDNF、Tnrc6a表达,与miR-30a对其靶分子表达水平的负性调节相吻合,提示BDNF和Tnrc6a可能与miR-30a参与MA强迫性用药的机制有关。(2)miR-30a的靶分子Tnrc6a对大鼠MA强迫性用药行为的影响目前关于Tnrc6a的研究主要在肿瘤相关领域,尚没有与药物成瘾等神经精神疾病的报道。我们利用靶向Tnrc6a的shRNA(sh-Tnrc6a)下调dlStr Tnrc6a的表达,在离体细胞和整体动物水平均证实了该shRNA能有效下调Tnrc6a表达水平。将携带sh-Tnrc6a的慢病毒(LV-sh-Tnrc6a)及携带阴性对照序列的慢病毒(LV-Con)分别微注射至大鼠双侧dlStr内,之后进行MA自身给药行为学检测。结果显示,与LV-Con相比,LV-sh-Tnrc6a能显著下调dlStr内Tnrc6a表达水平,但不影响长时程用药模式下MA诱发的大鼠递增性用药行为及药物摄入量,提示miR-30a不是通过靶分子TnrC6a参与甲基苯丙胺强迫性用药行为。(3)miR-30a的靶分子BDNF对大鼠MA强迫性用药行为的影响已有文献表明BDNF与可卡因、阿片、酒精成瘾有关,但尚无dlStr BDNF与MA成瘾的研究。我们采用与Tnrc6a研究中相同的策略下调dlStr内BDNF表达。结果显示,与LV-Con相比,LV-sh-BDNF能够显著下调dlStr内BDNF表达水平并降低长时程用药模式下MA诱发的大鼠递增性用药行为及药物摄入量,模拟了上调dlStr内miR-30a的作用,提示miR-30a可能通过靶分子BDNF参与调控MA强迫性用药行为。(4)BDNF下游通路对大鼠MA强迫性用药行为的影响根据文献报道,BDNF通过激活原肌球蛋白激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB),刺激细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸肌苷-3激酶(phosphoinositide-3kinase,PI3K)等通路而产生生物学效应。在本课题中,BDNF是通过哪条通路参与MA强迫性用药行为呢?MA自身给药模型下BDNF下游通路关键分子差异表达的研究结果显示,与Con组相比,LgA组大鼠dlStr亚区p-TrkB/TrkB、p-PI3K/PI3K水平显著升高,而p-ERK/ERK在ShA组显著升高。另外,在长时程自身给药训练模式下,双侧dlStr内微注射PI3K通路抑制剂LY294002能显著降低大鼠MA自身给药行为,而微注射ERK通路抑制剂U0126不影响大鼠的用药行为。因此,我们认为dlStr内miR-30a的靶分子BDNF正性调控MA强迫性用药行为,其机制可能是通过BDNF-TrkB激活下游PI3K通路实现的。结合文献报道的酒精强迫性用药的研究(上调dlStr BDNF通过激活TrkB-ERK通路降低大鼠的强迫性酒精摄入行为,与我们的结果相反),提示BDNF对不同类型成瘾性物质的成瘾行为呈现复杂的调节作用,即使在同一脑区(如dlStr)也可通过激活不同的下游通路介导截然相反的行为效应。3、miR-30a及靶分子BDNF与线索诱发的MA成瘾大鼠复吸行为的相关性以上研究发现,dlStr的miR-30a及其靶分子BDNF调控MA强迫性用药行为,那么是否与戒断后的复吸行为(觅药行为重建)也有关呢?本部分建立了大鼠MA强迫性用药模型,戒断一个月后进行线索诱发的觅药行为重建测试,结果显示一部分大鼠呈现高复吸倾向(观察时间内觅药次数为51.88±5.86),而另一部分大鼠表现为低复吸倾向(观察时间内觅药次数为25.83 ±2.41)。复吸测试完成后检测dlStr内miR-30a及BDNF的表达变化。与Con组(生理盐水自身给药)相比,低复吸组大鼠dlStr中miR-30a表达水平显著升高、BDNF mRNA水平无显著改变,而高复吸组miR-30a水平无显著改变、BDNF mRNA水平显著升高。另外,与低复吸组相比,高复吸组miR-30a表达水平显著降低以及BDNF表达水平显著升高。线性回归分析结果显示,miR-30a的表达水平与觅药次数呈负相关(r2=0.39,P<0.05),BDNF的表达水平与觅药次数呈正相关(r2=0.62,P<0.01)。以上结果提示,dlStr miR-30a及其靶分子BDNF可能与MA成瘾戒断后药物相关线索诱发的复吸行为有关,并可能具有预测复吸倾向的潜能。(二)dlStr的miR-134对MA成瘾行为的调节作用本部分重点研究了参与突触传递及可塑性的另一关键分子miR-134对MA强迫性用药的调节作用。1、MA主动给药和被动给药模型下大鼠纹状体亚区miR-134及其靶分子LIMK1的表达变化规律与上一部分miR-30a的研究策略相同,建立MA短时程自身给药(ShA组)和长时程自身给药(LgA组)模型。结果表明,LgA组大鼠dlStr中miR-134表达水平显著高于Con组和ShA组,miR-134靶分子LIMK1的mRNA和蛋白水平显著低于Con组和ShA组,而ShA组miR-134及LIMK1表达水平与Con组相比无差异。在dmStr中,三组大鼠miR-134以及LIMKl mRNA和蛋白表达水平均无显著差异;在NAc中,与Con组相比,LgA组miR-134水平轻微升高,而LIMK1水平没有显著变化。在MA被动给药模型下,Con组.、MA低剂量组(1lmg/kg,sc)和高剂量组(5mg/kg,sc)大鼠连续给药7天或28天后,dlStr、dmStr及NAc内miR-134和LIMK1 mRNA表达均无显著变化。以上结果提示,MA强迫性用药导致大鼠dlStr中miR-134表达显著升高、其靶分子LIMK1水平下降,此作用依赖于dlStr介导的刺激-反应(Stimulus-Response.,S-R)习惯学习。2、下调dlStr内miR-134对大鼠MA强迫性用药行为的影响我们采用miR-134海绵体下调miR-134水平。双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-134海绵体能功能性下调miR-134表达。将携带miR-134海绵体的慢病毒(LV-miR-134-Sil)微注射至大鼠dlStr内,免疫荧光染色结果显示LV-miR-134-Sil主要定位于大鼠dlStr的神经元中。将LV-miR-134-sil和阴性对照病毒(LV-NC)分别微注射至大鼠双侧dlStr中,然后进行MA长时程及短时程自身给药训练。结果显示,在LgA训练大鼠中,与LV-NC相比,LV-miR-134-sil显著下调dlStr内miR-134表达,同时伴随LIMK1水平上调、以及MA用药曲线和总药物摄入量的降低;但下调ShA训练大鼠dlStr内miR-134水平则不改变规律性用药行为和药物摄入量。这些结果提示,下调dlStrmiR-134水平可能通过减弱对靶分子LIMK1的表达抑制而降低大鼠MA强迫性用药行为,也支持了 dlStr控制的S-R习惯学习在强迫性用药中的重要作用的假说。三、研究结论1、在大鼠MA自身给药模型中,MA规律性用药转变为强迫性用药时,诱导miR-30a的表达下调由控制目标导向行为的NAc过渡到控制S-R习惯行为的dlStr;且dlStr的miR-30a负性调控MA强迫性用药行为,机制可能是通过其靶分子BDNF作用于TrkB受体及其下游PI3K通路实现的。另外,本文还发现dlStr的miR-30a及其靶分子BDNF的表达水平与MA强迫性用药大鼠戒断后线索诱发的复吸倾向性相关,提示miR-30a及BDNF可能作为MA成瘾复吸预警的潜在生物标志物值得进一步研究。2、对参与突触传递及可塑性的另一关键分子miR-134的研究发现,MA强迫性用药特异性诱导dlStr内miR-134表达上调,此作用依赖于S-R习惯学习;而dlStr的miR-134可能通过其靶分子LIMK1正性调控MA强迫性用药行为。因此,本文发现了 dlStr中miR-30a及miR-134对MA强迫性用药的调节作用及可能机制,从分子水平支持了dlStr介导的S-R习惯形成是由规律性药物使用向强迫性药物使用及成瘾过渡的重要机制的假说,为精确阐明药物成瘾的机制提供了实验证据。