糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以胰岛β细胞进行性功能衰竭导致血糖升高为主要病理生理过程的代谢性疾病。现行的治疗手段主要通过刺激患者体内残存胰岛功能,达到暂时平稳控制血糖水平的目的。但从远期疗效来看,随着残存胰岛负担的加重,最终会出现典型糖尿病症状和多种并发症。近年来的研究已经证实胰腺内存在干细胞,研究糖尿病病理状态下调控胰腺干细胞增殖分化为功能性胰岛β细胞,有望从细胞和分子水平治疗糖尿病。大量动物试验研究表明,补充适量牛磺酸能够降低糖尿病动物血糖水平,改善糖尿病症状,防止并发症的发生。本课题组前期通过动物试验进一步证实,牛磺酸能够增加STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛干细胞数量,上调胰腺干细胞表面标志物的表达,提示牛磺酸可能通过促进胰腺干细胞增殖及分化为成熟胰岛β细胞发挥降糖作用,但具体调控机制尚不清楚。本研究拟从细胞和分子水平研究牛磺酸对糖尿病大鼠胰腺干细胞增殖活性的影响及其调控机制,以期为临床应用牛磺酸防治人类及动物糖尿病提供理论依据。本研究主要分为三部分:(1)采用单次腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法建立大鼠糖尿病模型,从模型大鼠胰腺导管分离、提取、纯化胰腺干细胞,并进行体外传代培养;通过免疫细胞化学法鉴定胰腺干细胞表面标志物(Nestin、CK-19和PDX-1)的表达。(2)将糖尿病大鼠胰腺干细胞分为对照组(基础培养基)和牛磺酸组(基础培养基中加入10 mmol/L牛磺酸)。通过免疫荧光化学法定性、定量检测各组胰腺干细胞表面标志物(Nestin、CK-19和PDX-1)的表达情况;通过MTT法和流式细胞术分别检测牛磺酸对糖尿病大鼠胰腺干细胞增殖活力和细胞周期的作用;通过实时荧光定量PCR及Western-blot技术检测牛磺酸对糖尿病大鼠胰腺干细胞PCNA和Ki67 mRNA及蛋白表达的影响。(3)应用基因表达谱芯片筛选对照组和牛磺酸组胰腺干细胞差异表达的基因,差异分析的筛选标准为上调或者下调倍数变化值Fold change≥2.0,且p<0.05;通过GO富集分析和KEGG富集分析方法对差异基因参与的生物学功能和信号通路进行分析;应用实时荧光定量PCR法验证差异表达基因。得出试验结果如下:(1)采用单次腹腔注射STZ(50 mg/kg)的方法建立大鼠糖尿病模型,给药72 h后大鼠血糖显著升高,7天后表现出多饮、多食、多尿、消瘦的典型糖尿病症状,最终以血糖浓度≥16.7 mmol/L作为诱导糖尿病大鼠模型的成功标准,成模率为70%。此模型符合人类及动物糖尿病的发病特点,可以用于糖尿病大鼠胰腺干细胞的体外培养试验。(2)应用机械剪碎法和胶原酶消化法成功提取了胰腺导管上皮细胞,通过贴壁培养、换液洗涤和传代等方法,有效提高了胰腺干细胞纯度;经免疫细胞化学法鉴定干细胞表面标志物,Nestin、CK-19和PDX-1染色阳性细胞均达到85%以上,为后续试验提供了可靠的材料。(3)应用免疫荧光化学法定性、定量检测对照组和牛磺酸组胰腺干细胞表面标志物的表达,对免疫荧光染色阳性的图片进行半定量分析。结果表明:Nestin、CK-19、PDX-1在各组细胞胞浆染色均为阳性,而Glucagon和Insulin染色均为阴性;经牛磺酸处理,Nestin、CK-19、PDX-1三种抗原的荧光强度虽然略有增强,但没有显著差异(p>0.05)。说明从糖尿病大鼠提取的胰腺干细胞经牛磺酸处理后,其形态和干细胞表面标志物表达没有显著改变,可在体外培养并稳定传代。(4)应用MTT法检测体外培养糖尿病大鼠胰腺干细胞的增殖活力,牛磺酸作用24 h后胰腺干细胞增殖活力没有显著变化(p>0.05);随着牛磺酸作用时间延长,48h、72 h、96 h牛磺酸组胰腺干细胞增殖活力显著增强(p<0.01)。(5)应用流式细胞术分析牛磺酸对糖尿病大鼠胰腺干细胞周期的影响,对照组胰腺干细胞S期百分比和增殖指数分别为15.73%和50.77%,经牛磺酸处理,S期百分比和增殖指数分别提高到28.57%和61.02%,说明牛磺酸显著提高了糖尿病大鼠胰腺干细胞的增殖潜能(p<0.01)。(6)应用实时荧光定量PCR和Western Blot法,在转录和蛋白水平检测牛磺酸对细胞增殖相关抗原PCNA和Ki67表达的调控作用。结果显示:与对照组相比,牛磺酸组PCNA mRNA表达增加1.49倍,Ki67 mRNA表达增加2.12倍;对照组糖尿病大鼠胰腺干细胞PCNA和Ki67蛋白的相对表达量分别为0.26和0.34,牛磺酸组PCNA和Ki67蛋白的相对表达量分别为0.56和0.53,说明牛磺酸显著上调了PCNA与Ki67 m RNA和蛋白的表达(p<0.01)。(7)以STZ诱导糖尿病大鼠为研究对象,应用基因表达谱分析技术,筛选牛磺酸处理后大鼠胰腺干细胞差异表达基因。共筛选出差异表达的mRNA 3028个,其中上调mRNA 2268个(Fold change≥2,p<0.05),下调mRNA 760个(Fold change≤-2,p<0.05)。通过实时荧光定量PCR法对差异表达基因进行验证,其变化趋势与芯片结果基本一致,说明芯片数据结果可靠。(8)GO富集分析包括生物学过程、细胞组分、分子功能三大板块:整张芯片注释到生物学进程板块中GO的基因数为17184个,注释到GO的总靶基因数为1806个,差异基因参与调控的生物学进程依次为凋亡过程的负性调节、衰老、RNA聚合酶II启动子转录的正性调节、对缺氧的反应、创伤修复等;整张芯片注释到细胞组分板块中GO的基因数为17746个,注释到GO的总靶基因数为1863个,差异基因参与调控的细胞组分依次为细胞核、细胞质、细胞外的外泌体、细胞膜、粘合斑等;整张芯片注释到分子功能板块中GO的基因数为16594个,注释到GO的总靶基因数为1757个,差异基因参与调控的分子功能依次为蛋白结合、poly(A)RNA结合、ATP结合、蛋白质复合物结合、蛋白质异源二聚化活性等(FDR_bh<0.05)。(9)KEGG富集分析显示,整张芯片注释到KEGG的基因数为7808个,其中上调总靶基因数为702个,下调总靶基因数为216个。经牛磺酸处理后,上调差异基因参与的Pathway依次为肿瘤坏死因子信号通路、蛋白质在内质网的加工、癌症通路、NOD样受体信号通路、癌症相关蛋白聚糖等;下调差异基因参与的Pathway有2个,分别为酒精中毒和系统性红斑狼疮(FDR_bh<0.05)。(10)通过生物信息学综合分析,初步筛选出与牛磺酸促胰腺干细胞增殖相关的10条通路,分别是TNF信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-AKt信号通路、Fox O信号通路、TGF-β信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、Notch信号通路和Wnt信号通路。进一步分析各通路关键调控靶点的基因表达变化,确定NF-κB和Ras/ERK信号通路为牛磺酸促胰腺干细胞增殖密切相关的通路。通过实时荧光定量PCR法证实牛磺酸显著上调了NF-κB和Ras/ERK信号通路中关键靶点mRNA水平(Chuk、Egfr、Il1r1、Mapk1、Mki67、Nfkb1、Nras、Pcna、Pdgfra、Rela、Ripk1、Tlr4)(p<0.01),表明牛磺酸通过NF-κB和Ras/ERK信号通路促进了糖尿病大鼠胰腺干细胞的增殖。综上所述,本研究通过腹腔注射STZ法建立了大鼠糖尿病模型,并从该模型大鼠胰腺导管成功提取、分离、纯化胰腺干细胞,在体外稳定传代培养;牛磺酸显著增加了糖尿病大鼠胰腺干细胞活力、细胞周期中DNA合成期的比例和增殖指数,显著上调了细胞增殖相关抗原m RNA和蛋白的表达;牛磺酸通过NF-κB和Ras/ERK信号通路促进了糖尿病大鼠胰腺干细胞的增殖。