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酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是一种因长期过量饮酒引起的肝脏系统性疾病。ALD是一个复杂的病理过程,其包括酒精性脂肪肝,酒精性肝炎,酒精性肝纤维化,酒精性肝硬化,最终甚至发展成为肝癌。酒精性脂肪肝(Alcoholic fattv liver disease,AFLD)被认为是ALD病理发展的最初阶段,其主要是以脂肪堆积,少量炎症细胞浸润同时伴有轻微的肝细胞损伤为特征的肝脏疾病。脂肪变性若得不到有效控制,可导致肝细胞坏死,肝细胞功能受到破坏,进一步的破坏肝脏功能使病情恶化。因此,研究酒精引起脂质代谢紊乱的调节机制对AFLD的治疗及预防至关重要。研究表明Rev-erbα参与了多种与脂质代谢相关的疾病过程,但Rev-erbα是否参与AFLD病程中的脂质代谢尚未见报道。本研究旨在探讨Rev-erbα是否可以通过调控脂肪变性参与AFLD的发生发展过程,并探讨Rev-erbα调控脂肪变性可能的分子机制。研究内容主要概况如下:1.Rev-erbα在EtOH-fed小鼠肝脏和乙醇诱导的L02细胞中的表达体内采用Binge模型进行AFLD的造模,H&E、油红O染色结果表明EtOH-fed组小鼠肝组织中脂肪空泡较多,脂滴沉积明显。EtOH-fed组小鼠血清中甘油三脂(Triglyceride,TG),总胆固醇(Total cholesterol,T-CHO)和丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)的水平明显升高。体外采用150 mmol/L的EtOH刺激L02细胞48 h,油红O染色、细胞内TG含量检测、RT-PCR以及Western blot检测结果鉴定乙醇刺激可引起细胞内脂质代谢紊乱。结果显示乙醇刺激后,细胞内的脂滴沉积明显,甘油三酯水平升高,Pparα的表达降低,Srebp1c的表达升高。比较Rev-erbα和Rev-erbβ在EtOH-fed小鼠肝脏和乙醇诱导的L02细胞中的表达发现,CD-fed组小鼠肝组织和Control组L02细胞中Rev-erbα mRNA的表达明显高于Rev-erbβ,EtOH-fed组小鼠和EtOH刺激组L02细胞中Rev-erbα mRNA的表达显著升高,而Rev-erbβ的表达却没有明显的变化。通过免疫组化,免疫荧光,RT-PCR以及Western blot结果表明Rev-erbα在EtOH-fed小鼠肝组织和乙醇刺激的L02细胞中的表达明显升高,且只在细胞核中的表达升高而在细胞质中的表达没有明显变化。体外使用Rev-erbα激动剂GSK4112刺激L02细胞24 h,细胞内脂滴沉积明显增加,甘油三酯水平上升,同时Pparα的表达降低,Srebplc的表达升高。2.Rev-erbα对EtOH-fed小鼠肝组织和乙醇诱导的L02细胞中脂质代谢的影响体内,我们采用酒精性液体饲料喂养小鼠,造模期间小鼠尾静脉注射Rev-erbα拮抗剂SR8278(10μM,3天),H&E,油红O染色以及免疫组化结果显示,与EtOH-fed小鼠相比,给予SR8278拮抗剂后,小鼠肝组织脂肪空泡明显减少,脂滴沉积得到缓解,肝损伤明显降低,并且给与SR8278拮抗剂后,肝组织中Pparα和Srebp1c蛋白的异常表达得到缓解。体外,我们采用Rev-erbα ShRNA建立L02细胞内Rev-erbα的沉默模型,同时用乙醇刺激L02细胞48 h,油红O染色,TG的含量检测,RT-PCR以及Western blot结果表明,Rev-erbα沉默后,细胞内脂滴沉积得到缓解。与EtOH+Control ShRNA组相比,EtOH+Rev-erbα ShRNA组细胞内TG含量与脂滴沉积明显降低,同时Pparα和Srebp1c的差异表达得到改善。给予乙醇诱导的L02细胞SR8278(Rev-erbα拮抗剂,10 μM,24 h)后,上述结果同样被发现。3.Rev-erbα调控脂肪变性的机制研究3.1自噬在EtOH-fed小鼠肝组织和乙醇诱导的L02细胞中的表达透射电镜和免疫组化结果表明EtOH-fed组小鼠肝组织中自噬形成减少。体外,Western blot和Lyso Tracker Green DND-26溶酶体探针检测结果表明自噬活性在EtOH刺激组L02细胞中也明显降低。3.2 Rev-erbα对EtOH-fed小鼠和乙醇诱导的L02细胞中自噬的影响为了进一步研究Rev-erbα对EtOH-fed小鼠和乙醇诱导的L02细胞中自噬活性的影响,对EtOH-fed小鼠尾静脉注射SR8278,透射电镜和免疫组化结果表明给予SR8278后,自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated light chain 3,Lc3)形成增加,P62的表达降低。体外,Western blot和Lyso Tracker Green DND-26溶酶体探针检测结果表明Rev-erbα沉默或给予Rev-erbα拮抗剂后,Lc3和Beclin1的蛋白表达增加,P62的表达降低,同时溶酶体的酸度也升高。提示Rev-erbα可能通过调控自噬的活性影响脂肪变性。3.3 Bmall对Rev-erbα调控自噬活性的影响为了进一步探讨Rev-erbα调节脂质代谢的机制,使用Rev-erbα ShRNA沉默Rev-erbα后,Bmal1的表达上升。而Bmal1在EtOH-fed小鼠肝组织和乙醇诱导的L02细胞中的表达降低。进一步在Rev-erbα沉默模型上下调Bmal1后,Lc3的表达下降,而P62的表达升高,溶酶体的酸度也降低,Western blot检测结果表明Bmal1下调后,Pparα的表达也随之下调。结果提示,Rev-erbα可能靶向Bmal1负性调控自噬进而影响肝脂肪变性。