疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase,TLL）是一种耐热性好、位置特异性和区域选择性较强的脂肪酶,在洗涤剂、化妆品、生物化工等领域有良好的应用前景。但目前商品化的TLL多是固定化酶,在经分离纯化获得游离酶蛋白后还需要固定化,因而价格偏高,限制了广泛应用。酵母表面展示技术是近年研究热点之一,借助基因工程方法将细胞壁蛋白与酶蛋白的融合,从而实现在标准发酵过程中,将外源蛋白固定于酵母细胞表面,类似于酶的固定化。毕赤酵母表面展示系统是发展迅速且应用前景广阔的真核表达系统,它不仅具有分子遗传操作简单的优点,同时能够在强诱导性启动子AOX1的作用下实现高密度表达。因此,将TLL展示在毕赤酵母表面为寻求性价比更高的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化剂提供了良好的思路。目前对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的研究相比其它脂肪酶而言比较少,在TLL1（GenBank:ABV69591.1）和TLL2（NCBI Accession:O59952）这两个基因上也只有少数研究报道。本课题首先将TLL1优化后的基因,分别以带自身信号肽序列片段和不带自身信号肽序列片段的形式,与毕赤酵母内源壁蛋白Gcw51p、Gcw61p的基因串联,构建了pPIC9k-sTLL1-GCW61、pPIC9k-TLL1（Δsig）-GCW61、pPIC9k-sTLL1-GCW51和pPIC9k-TLL1（Δsig）-GCW51四种展示表达质粒。然后将这四种质粒转入毕赤酵母GS115,从而构建出四种相应的高水解酶活的重组表面展示菌株。然后将所得四种菌株进行摇瓶水平发酵,并对脂肪酶表达情况进行了研究。结果表明,疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶成功在毕赤酵母表面展示,并表现出一定水解活力,具体为GS115/pPIC9k-s TLL1-GCW61,205.24U/g;GS115/pPIC9k-TLL1（Δsig）-GCW61,118.69U/g;GS115/pPIC9k-sTLL1-GCW51,97.33U/g;GS115/pPIC9k-TLL1（Δsig）-GCW51,26.50U/g。初步得出结论:（1）该展示系统有效,（2）对于TLL,锚定蛋白Gcw61p展示效果好于锚定蛋白Gcw51p,（3）对于TLL,带目的基因自身信号肽的酶活高于不带目的基因自身信号肽的。其次将TLL2做目的基因,构建了GS115/pPIC9k-TLL2-GCW61和GS115/pPIC9k-TLL2-GCW51展示表达菌株,其酶活为172.34U/g和84.19U/g。由于酶活未有提高,故改用本实验室构建并改造后的PHKA-AOX高分泌表达质粒作展示表达质粒,并通过三丁酸甘油酯平板初筛和摇瓶水平复筛,筛选出GS115/PHKA-AOX-TLL2-GCW61展示表达菌株,其摇瓶发酵144h后,菌体酶活最高可达1964.76U/g。然后对GS115/PHKA-AOX-TLL2-GCW61进行了免疫荧光标记,进一步确证脂肪酶被展示在细胞表面。其发酶液经真空冷冻干燥后,用于该脂肪酶酶学性质的研究。其最适底物为对硝基苯酚己酸酯,最适作用温度为55℃,最适作用pH为9.0,在70℃中保存90min,酶活力仍保存70%以上,具有较高耐热的特性。Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对酶有强烈的激活作用,Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Li⁺、Na⁺、Co²⁺对酶有强烈抑制作用,Ba²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺对酶影响不大。本课题所构建的展示TLL2全细胞催化剂,具高酶活、耐碱性和热稳定高等特点,这为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在工业上广泛应用奠定一定基础,也为其他脂肪酶的工业化应用提供解决思路。