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【目的】:制备双砷染料标记的荧光乙型肝炎病毒(hepatits B virus,HBV)体,对其形态学进行鉴定分析,并动态观察HBV荧光体在活细胞中的生物学行为。【方法】:采用脂质体介导的方法,将已成功构建带有TC标签的1.3倍乙型肝炎病毒基因组的载体质粒(pTHBV1.3-mTC1)瞬时转染入人肝癌细胞株中,该重组载体是通过PCR定点基因突变技术将一个能与双砷荧光染料特异性结合的TC标签(C-C-P-G-C-C)在基因水平上插入到HBV核心蛋白免疫主区c/el位点。48h后通过间接免疫荧光检测表面抗原在细胞内的表达与分布;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中乙肝表面抗原(HBsAg)的表达;同时收集转染细胞上清液,经不连续蔗糖密度梯度离心进行分离和纯化后,加抗体孵育进行免疫电镜观察分析,同等培养条件下HepG2细胞和2.2.15细胞培养上清液分别作为阴性和阳性对照。活细胞研究中,我们应用Oregon Green ? 488 Taxol标记微管骨架后,在活细胞时差共聚焦显微镜下观察荧光HBV病毒体在宿主细胞中的运输过程。【结果】:间接免疫荧光结果显示在转染pTHBV1.3-mTC1组细胞中双砷的红色荧光强于转染pTHBV1.3细胞组,呈典型的核浆型分布。电镜结果显示,转染pTHBV1.3组细胞在48h时可表达HBsAg并可自行组装成12nm左右的球形颗粒后分泌至上清中,而阴性对照组和pTHBV1.3-mTC1组未见到与文献报道一致的HBV颗粒样结构。活细胞时差共聚焦显微镜观察显示荧光HBV颗粒感染HepG2细胞后约3h荧光颗粒开始吸附并侵入胞内,约5h时在胞浆中富集而少数已到达核周,并可观察到荧光HBV颗粒依赖于微管的运动。初步证实重组的HBV荧光体同野生型HBV一样保留了抗原性和感染性。【结论】:TC嵌合型核心蛋白在转染pTHBV1.3-mTC1细胞中能够特异性的发出荧光,且TC标签的插入并不影响表面抗原及核心蛋白的表达。双砷复合物这一新颖荧光标记技术使得HBV在活细胞中的示踪观察成为可能。在深入研究HBV荧光体在胞浆中运输的动态过程及与宿主细胞间的相互关系方面,可作为一种高度有价值的研究工具。