亚硝酸盐在人类生活环境中广为存在,食物来源的亚硝酸盐是人体摄入亚硝酸盐的主要途径。过量的亚硝酸盐能够造成人体亚硝酸盐中毒,同时亚硝酸盐能够在酸性条件下在体内生成亚硝胺——后者为强烈的致癌物。食品中亚硝酸盐安全问题备受关注,但尚没有在大型真菌中发现能够降解亚硝酸盐的菌株。美味牛肝菌是一种著名的野生食用菌,食药用价值潜力巨大。本研究以美味牛肝菌具有降低泡菜发酵中的亚硝酸盐作用为基础,证明该作用依赖于美味牛肝菌所含有的亚硝酸盐还原酶,并对该酶进行了分离纯化、生理生化性质检测以及分子克隆等研究。本研究一方面丰富了了亚硝酸盐还原酶的资源库,另一方面,针对该降亚硝酸盐机理的研究也为应对亚硝酸盐带来的健康威胁提供给了新的思路和理论基础。运用硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等手段,从美味牛肝菌子实体中提纯了一种亚硝酸盐还原酶,该酶分子量为90kDa,具有两个相同的亚基。纯酶的比活为11.8 U/mg,其纯化倍数达15.5倍,回收率为1.2%。该酶的最适温度为45-50℃,最适反应pH为中性。金属离子Fe3+和Cu2+对该酶活性影响较大。Fe3+促进酶活性,且促进作用与离子浓度有关。低浓度的Cu2+离子抑制酶活,随着浓度升高,对酶活的作用由抑制变为促进。对该亚硝酸盐还原酶的酶促反应动力学研究证明该酶的Km和Vmax值分别为19.73mM和2.95mg·L-1·min-1。本研究同时检测了该酶在体内对亚硝酸盐的清除作用。通过给药剂量和时间的摸索,分别建立了急性亚硝酸盐中毒小鼠模型和大鼠模型。对于低、中、高3种不同程度的亚硝酸盐中毒小鼠模型,低浓度亚硝酸盐中毒的小鼠不致死,中浓度以及高浓度中毒的小鼠分别在灌胃亚硝酸盐18.1±9.5 min和11.5±3.7min死亡。实验发现,对中毒的小鼠同时灌胃亚硝酸盐还原酶液能够有效缓解其中毒症状,延长其存活时间,其酶量越大,小鼠存活时间越长,解毒效果越好。说明该亚硝酸盐还原酶是一种亚硝酸盐中毒的解毒剂。对于亚硝酸盐中毒的大鼠,该酶液可以降低其血液中亚硝酸盐的含量,推迟亚硝酸峰值出现的时间,酶量越大,降低作用越明显,高浓度酶量组甚至不出现明显的亚硝酸盐峰。为了延长该酶在体内的作用时间,本研究将亚硝酸盐还原酶冻干粉装填肠溶胶囊,并对大鼠连续灌胃亚硝酸盐模型给药。经过胶囊包装,该酶在体内的有效作用时间推迟到2h之后,且持续作用时间为4h。通过该酶的N端15个氨基酸序列在美味牛肝菌基因库中检索到了该酶的DNA和蛋白序列信息,并利用分子生物学手段,从本研究的实验材料美味牛肝菌中获得了编码该酶的cDNA序列和蛋白序列,与基因库的蛋白相似性约为90%。经过人工合成,获得了该DNA序列,分别构建了原核表达质粒pET-28a-nir和真核表达质粒pPIC9K-nir,并分别转化到原核表达菌株BL21(DE3)和真核表达菌株毕赤酵母GS115,两个表达质粒在DNA水平上均证明了重组菌株构建成功,在蛋白表达水平上,pET-28a-nir/BL21 (DE3)经IPTG诱导表达产物有目的条带出现,但表现为包涵体；pPIC9K-nir/GS115经甲醇诱导表达发酵液上清中没有出现目的产物。