根皮苷是苹果多酚中最具代表性的一种多酚类成分,能防御紫外线,抑制火疫病菌、黑星病菌等,对苹果的生长具有十分重要的意义,此外还具有抗氧化性、清除体内自由基、降低血糖、保护心脏、改善记忆力和美白等多种生物活性。在苹果体内UDPG:根皮素-2’-O-糖基转移酶(MdP2’GT)催化根皮素转化为根皮苷,是根皮苷生物合成的关键酶。开展苹果相关组织中根皮素糖基转移酶编码基因、发育调节特性的研究,对阐明苹果特征酚根皮苷的生物合成机理及调节机制有一定的意义。本研究选择具有代表性的早、中、晚熟苹果品种,对苹果根皮素糖基转移酶基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达、表达量分析;研究生长期内7个品种苹果不同组织根皮苷含量变化与酶活关系;研究根皮素糖基转移酶分离纯化及酶学特性;研究苹果多酚的抗氧化性及抗菌性等。主要结果如下:(1)UGT71A15、UGT71K1和UGT88F1基因cDNA长度分别为1416、1434和1452 bp;其二级结构中含有较多的α-螺旋,占40~46%;N端和C端均有典型的Rossmann折叠,含有PLN02992结构域;均具有亲水性,不含跨膜结构域,无信号肽,存在于叶绿体或细胞质。UGT88F1与UGT88F家族的氨基酸序列同源性较高,达到79.9~99%,但是与其他糖基转移酶的同源性并不高,只有34.2~53%。UGT71A15除与UGT71A16具有92%同源性外,与其他糖基转移酶具有32.7~58%的同源性。UGT71K1除与UGT71K2具有94%同源性外,与其他糖基转移酶具有33.2~46.6%的同源性。将UGT88F1基因的PCR产物连接到pET-32a(+)表达载体上,热激法转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞后,筛选重组子,得到重组质粒;对重组质粒双酶切鉴定阳性克隆、测序,对含有重组质粒的菌体进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,融合蛋白表达效果较好。(2)经Real-time quantitative PCR分析,根皮素糖基转移酶基因在芽、花、叶片及果实中都有表达,但表达量有差异。UGT71A15和UGT71K1在叶片中表达量较高,UGT71K1和UGT88F1在果皮中表达量较高。在3个品种苹果叶片中,UGT71A15、UGT71K1和UGT88F1 3个基因的表达量先升高后降低,在衰老叶中表达量迅速增加。但3个基因达到峰值的时间各不相同。在3个品种苹果果皮中,UGT71A15在整个生长过程中表达量一直保持在低水平,且变化不大;UGT71K1在幼果中的表达量较高,随果实生长,表达量迅速降低,然后一直保持在很低水平;UGT88F1表达量随果实生长迅速增大,然后逐渐降低。叶片MdP2’GT酶蛋白表达主要受转录水平调控,果皮MdP2’GT酶蛋白表达受转录和翻译水平共同调控。(3)7个品种苹果在生长期内芽、叶片、果皮、籽中根皮苷含量差异显著,叶片中根皮苷的含量最高,依次为芽、籽,果皮中含量较低。生长期内7个品种苹果叶片、果皮、籽根皮苷含量变化都呈现一定的规律性。对于苹果叶片,根皮苷含量出现1~2个峰,早熟、中熟品种出现第1个峰的时间较早,而晚熟品种出现高峰的时间较晚;对于苹果籽,早熟品种根皮苷含量在花后55 d出现峰值,而中熟品种和晚熟品种出现峰值的时间推后20天,在花后75 d出现峰值;对于苹果果皮,花后20 d根皮苷含量最高,在幼果期,果皮中根皮苷含量迅速下降,然后缓慢降低直到果实成熟。苹果芽、叶片和果皮根皮苷含量与MdP2’GT酶活呈正相关性。(4)以苹果叶片为原料,通过饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G75凝胶过滤色谱纯化,获得纯化后的根皮素糖基转移酶,其比酶活达到632.0 U/mg,纯化倍数为71.0倍,回收率达到42.6%。SDS-PAGE鉴定其表观分子量为50 kDa。酶的最适pH值为8.5,最适温度为45℃。以根皮素为底物测定的Km为3.16μM,Vmax为0.77 nM/min·mg蛋白。金属离子在反应体系的终浓度为5 mM时,Ca2+和Mg2+对该苹果根皮素糖基转移酶有促进作用,Na+和K+作用不明显,Al3+、Cu2+、Mn 2+和Zn2+有显著的抑制作用,Cu2+的抑制作用最强。(5)7个品种苹果叶总酚含量26.74~148.99 mg GAE/g DW,秦冠抗氧化能力最强,秦阳和红盖露较强,蜜脆、富士、红星和黄元帅较弱。根皮苷清除自由基的能力介于VC和BHT之间。秦冠苹果叶多酚和其含有的各种多酚对五种受试菌都显现出抑菌活性,抑菌效果明显优于其含有的各种单酚,其抑菌性是茶多酚的3~4倍。根皮苷不含邻位羟基对受试菌的抑菌效果弱于绿原酸、儿茶素等含有邻位羟基的酚类。