肺癌是世界范围内最高发的恶性肿瘤之一,深入探讨其发病机制、准确鉴别肺鳞癌与腺癌,对于非小细胞肺癌(Non-Small-Cell lung cancer,NSCLC)患者的诊断和治疗意义重大。MicroRNA(miRNA)是一种精细调节基因表达的内源性分子,不仅可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的形成与进展过程,而且其检测被认为是辅助肿瘤诊断、预后判断以及疗效评价等方面重要的生物标记,可见miRNA调控是一种重要的肿瘤相关分子机制。我们前期利用深度测序技术对肺鳞癌与腺癌组织中差异表达的miRNAs进行筛选,发现miR-944在肺鳞癌中的表达显著高于正常肺组织以及腺癌组织。此外,miR-944定位于p63基因内含子区,为p63基因的内含子mi RNA(Intronic miRNAs)。但是,目前有关miR-944在NSCLC中的作用、与其Host gene p63表达的相关性、在肺鳞癌与腺癌鉴别诊断中的意义等问题尚不明确。本研究中我们针对上述问题展开研究,主要包括以下三方面内容:1.观察miR-944在非小细胞肺癌细胞中的作用;2.揭示mi R-944与其Host gene p63表达的相关性及可能机制;3.探讨miR-944在手术切除标本及支气管灌洗液标本肺鳞癌与腺癌诊断中的作用。研究结果可为肺鳞癌的病因及发病机制、肺鳞癌与腺癌的鉴别诊断提供理论依据。第一部分:miR-944在非小细胞肺癌细胞中生物学作用的体外实验研究目的:从细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期分布方面观察miR-944在NSCLC细胞的作用。方法:体外培养肺腺癌A549、肺鳞癌SK-MES-1、H1703和H520细胞、以及皮肤鳞癌A431细胞(典型鳞癌细胞对照),分别转染miR-944mimics或inhibitors,采用Taqman microRNA assay方法检测转染效率;采用MTT及多功能实时细胞分析仪(Real-Time Cellular Analysis,RTCA)检测细胞增殖;采用细胞划痕实验、Transwell小室和RTCA检测细胞迁移能力;采用FCM方法检测细胞凋亡及细胞周期分布情况。每组实验重复三次。所有数据应用SPSS Statistics17.0统计软件进行分析,P<0.05为有显著差异。结果:1.过表达或敲低miR-944效率检测:miR-944 mimics分别转染A549、H1703、H520及A431细胞后,miR-944表达较对照组显著增加(P<0.05)。转染mi R-944 inhibitors后,SK-MES-1细胞中miR-944表达较对照组显著抑制(P<0.05)。2.miR-944对细胞增殖的影响:MTT检测结果表明,mi R-944 mimics转染后A431细胞在24h-96h增殖活性均明显高于对照组(P<0.05);A549细胞在48h、72h和96h增殖活性明显高于对照组(P<0.05);H1703细胞转染后在72h、96h增殖活性明显高于对照组(P<0.05)。RTCA检测结果与MTT方法基本一致,两种方法的应用保证实验结果的可重复性。此外,MTT以及RTCA检测结果表明,miR-944 inhibitors转染SK-MES-1细胞后48h和72h,细胞增殖活性均明显低于对照组(P<0.05)。3.miR-944对细胞凋亡的影响:A549细胞miR-944 mimics组细胞凋亡率为7.93%±0.89%,明显低于对照组(15.6%±0.93%,P<0.05)。A431细胞miR-944 mimics组细胞凋亡率明显低于对照组细胞(14.2%±1.02%V.S.9.3%±0.83%,P<0.05)。而在H1703和H520细胞中细胞凋亡无明显改变。此外,与对照组(14.3%±0.98%)相比,miR-944 inhibitors转染SK-MES-1细胞的凋亡率(7.9%±0.91%)明显增加(P<0.05)。4.miR-944对细胞迁移能力的影响细胞划痕实验结果表明,过表达miR-944后A549、H1703及A431细胞划痕的愈合面积明显高于对照组细胞(P<0.05);Transwell小室实验表明,A549、H1703及A431细胞miR-944 mimics转染组穿过膜的细胞数目明显多于对照组(P<0.05);RTCA检测同样证实,miR-944 mimics转染组A549、H1703及A431细胞穿过下室的细胞数明显高于对照组(P<0.05),提示过表达miR-944可促进细胞迁移能力。此外,三种方法一致表明,miR-944 inhibitors转染组SK-MES-1细胞迁移能力显著低于对照组细胞(P<0.05)。5.miR-944对细胞周期分布的影响:FCM检测结果表明,过表达或敲低miR-944对细胞周期分布均无显著影响。小结:1.miR-944参与调控细胞的增殖过程。过表达miR-944可促进A549、H1703及A431细胞增殖,而敲低miR-944可抑制SK-MES-1细胞的增殖过程。2.miR-944参与调控细胞的迁移过程。过表达miR-944可促进A549、H1703及A431细胞迁移,而敲低miR-944表达可抑制SK-MES-1细胞的迁移能力。3.过表达或敲低miR-944可抑制或增加细胞凋亡,但是对细胞周期无明显影响。综合结果表明,miR-944发挥癌基因作用,参与NSCLC细胞的增殖、凋亡及细胞迁移等过程。第二部分:miR-944与Host gene p63在非小细胞肺癌中表达的相关性研究目的:观察miR-944与其Host gene p63表达间的调控作用,并就miR-944对p63基因表达的调控机制进行探讨。方法:体外培养NSCLC细胞及A431细胞;观察TGF-β处理诱导p63表达、或siRNA转染敲低p63表达对mi R-944表达的影响;采用Real-time PCR及Western Blot方法,检测过表达miR-944对p63表达的影响;siRNA转染敲低细胞中YAP1或TAZ表达对p63表达的影响;同时检测miR-944对YAP1或TAZ表达的影响;进一步收集术前未经放疗或化疗的原发NSCLC手术切除石蜡组织标本90例,采用免疫组化方法检测YAP1与p63蛋白表达,并结合miR-944表达分析三者表达的相关性。应用SPSS Statistics17.0软件进行统计分析,P<0.05为有显著差异。结果:1.p63对miR-944表达的调控作用:参照文献,给予A431细胞TGF-β处理20h,细胞中p63在mRNA和蛋白水平被显著诱导表达,同时miR-944表达伴随p63表达而增加(P<0.05)。进一步转染p63siRNA敲低A431、SK-MES-1细胞中p63表达后,miR-944表达亦显著降低(P<0.05),结果提示p63可调控mi R-944表达。2.miR-944对其Host gene p63表达的影响:将miR-944 mimics分别转染A549、H520、A431细胞,过表达miR-944后可见上述3种细胞中p63在mRNA及蛋白水平均表现不同程度增高(P<0.05)。此外,转染mi R-944 inhibitors抑制SK-MES-1细胞中miR-944表达后,p63表达也显著降低(P<0.05),提示miR-944可调控Host gene p63表达。3.YAP1/TAZ对细胞中p63表达的影响:分别将YAP1 siRNA、TAZ siRNA转染A549、H520、A431细胞,在YAP1和TAZ表达显著抑制的同时,三种细胞中p63在mRNA和蛋白水平均显著增加(P<0.05),表明YAP1/TAZ可负向调节p63表达。4.miR-944对YAP1/TAZ表达的影响:miR-944 mimics转染A549、H520和A431细胞后观察对YAP1/TAZ表达的影响。A549细胞中,过表达miR-944可显著抑制YAP1与TAZ在mRNA及蛋白水平表达(P<0.05);H520细胞中,过表达miR-944可抑制YAP1在mRNA及蛋白水平表达(P<0.05),同时抑制TAZ mRNA表达(P<0.05);A431细胞中,过表达miR-944可抑制TAZ mRNA表达(P<0.05)。结果表明miR-944可不同程度地抑制YAP1/TAZ表达。5.YAP1及p63在NSCLC组织中的表达及与临床病理特征的相关分析:免疫组化检测结果表明,在90例肺癌组织中,YAP1阳性表达率为77%(69/90),其中50%的病例中呈现高表达,并且在肺腺癌组织中的高表达率显著高于鳞癌组织(79%V.S.25%,P<0.05)。p63阳性表达率为53%(48/90),其在肺鳞癌组织中的表达显著高于肺腺癌中(100%V.S.0%,P<0.05)。进一步分析发现两者表达均与性别有关,YAP1表达在女性高于男性(P<0.05),而p63表达在男性高于女性(P<0.05)。此外,p63表达与肿瘤大小显著相关(P<0.05)。6.miR-944、p63及YAP1在NSCLC组织中表达的相关分析:90例NSCLC组织中,miR-944在鳞癌中的表达显著高于腺癌组织(P<0.05)。Spearman相关分析表明,90例NSCLC组织中,miR-944与p63表达呈显著正相关关系(r=0.955,P<0.05),两者与YAP1表达均呈明显负相关关系(miR-944与YAP1:r=﹣0.535,P<0.05;p63与YAP1:r=﹣0.535 P<0.05)。小结:1.诱导细胞中p63表达可增加miR-944表达,敲低细胞中p63表达后miR-944表达也随之降低,表明p63可正向调控miR-944表达。2.过表达或敲低miR-944可显著增加或降低细胞中p63表达,表明miR-944可以正向调控多个细胞中p63表达,结果提示miR-944与其Host gene p63基因以正反馈方式相互调节表达。3.YAP1/TAZ可抑制细胞中p63基因表达,而miR-944过表达可抑制YAP1或TAZ表达,解除YAP1/TAZ对p63基因的抑制作用,是miR-944促进其Host gene p63表达的机制之一。4.YAP1蛋白在肺腺癌组织中的表达显著高于肺鳞癌,而P63蛋白阳性表达主要见于肺鳞癌中,且与肿瘤大小或性别相关。5.NSCLC组织中miR-944与p63蛋白表达呈显著正相关关系,两者与YAP1表达呈显著负相关关系。第三部分:miR-944在肺鳞癌与肺腺癌病理诊断中的作用目的:筛选验证miR-944等miRNAs在肺鳞癌与腺癌鉴别诊断中的意义。方法:收集术前未经放疗化疗的原发NSCLC患者手术切除新鲜标本128例、石蜡包埋组织112例以及支气管灌洗液(BAL)样本127例。按照试剂盒步骤提取上述组织或细胞中的总RNA,采用Taqman microRNA assay方法检测组织中miRNAs表达;应用微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)技术检测支气管灌洗液细胞中miRNAs表达。通过逐步logistic回归模型(Stepwise logistic regression models)确立miRNAs诊断标记物组,进一步采用多元线性模型(Stepwise backward model)筛选最适于肺鳞癌与腺癌鉴别诊断的miRNA分子;利用ROC曲线(Receiver Operating Characteristic)及曲线下面积(Aera Under the ROC Curve,AUC)评价miRNA在肺鳞癌与腺癌诊断的准确性;采用McNemar卡方检验分析miRNA模型与细胞学检测的差异。此外,为了评价miR-944的转录成熟过程,进一步采用Taqman探针法检测11例新鲜冻存鳞癌组织中Pri-miR-944表达情况。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.建立肺鳞癌与腺癌鉴别相关miRNA-based模型:根据之前筛选结果以及文献报道,选择7个miRNAs在128例(62例鳞癌、66例腺癌)新鲜组织中进行检测。结果表明,除外miR-21-5p,6个mi RNAs(miRs-205-5p,-944,-34a,-135a-5p,-375,-577)在肺鳞癌与腺癌组织中表达差异显著(P<0.05),其中以mi R-205-5p、miR-944差异最为显著。进一步统计分析发现,miRNA-based模型(mi R-205-5p与miR-944联合检测)鉴别肺鳞癌与腺癌的AUC值为0.988,准确性、灵敏度和特异性分别为96.48%、96.55%和96.43%。2.验证肺鳞癌与腺癌鉴别相关miRNA-based模型:在112例(鳞癌55例、腺癌57例)石蜡组织中验证miR-205-5p以及miR-944表达及诊断意义。结果表明,miR-205-5p以及miR-944表达在鳞癌组织中显著高于腺癌(P<0.05),且两者联合检测鉴别肺鳞癌与腺癌的AUC值为0.986,准确性、灵敏度和特异性均为96.43%,表明miRNA-based模型在肺鳞癌和腺癌鉴别中具有很高的预测意义。3.miRNA-based模型在支气管灌洗液标本诊断中的意义:进一步在127例(鳞癌82例、腺癌45例)BAL标本中分析miR-205-5p以及mi R-944表达及应用价值。结果表明,两者联合检测鉴别肺鳞癌与腺癌的AUC值为0.997,准确性、灵敏度和特异性分别为96.12%、95.00%和96.83%。而细胞学检测仅在58例BAL标本中能够进行形态学诊断(45.6%),显著低于miRNAs标记物的诊断率(P<0.05)。4.Pri-miR-944与成熟miR-944表达的关系:以miR-205为参照,在11例新鲜冻存SCC组织中分析了Pri-miR-944与成熟mi R-944表达的相对比值。结果表明,成熟miR-205-5p的表达量显著高其初级转录本Pri-miR-205的表达(P<0.05),但是成熟miR-944与Pri-miR-944表达无明显差异。与mi R-205/Pri-miR-205相比,11例SCC组织中mi R-944/Pri-mi R-944的比值显著降低(P<0.05)。小结:1.miR-205-5p、miR-944、mi R-34a、miR-135a-5p、miR-375、miR-577在肺鳞癌和腺癌中的表达均有显著差异,其中miR-944、miR-205-5p在肺鳞癌中高表达最为显著。2.NSCLC新鲜冻存组织以及石蜡组织中联合检测miR-205-5p与miR-944表达均可作为肺鳞癌与腺癌鉴别的重要标记分子。3.与细胞学检测相比,在支气管灌洗液标本中联合检测miR-205-5p与miR-944表达,不仅可以显著提高肺癌的诊断率,同时可以区分肺鳞癌与腺癌组织学类型。4.从初级转录本到成熟过程中miR-944的效率低于miR-205-5p,是引起mi R-944在NSCLC组织中相对低表达的原因之一。结论:1.miR-944参与调控NSCLC细胞及皮肤鳞癌A431细胞的增殖、迁移及凋亡过程,发挥癌基因作用。2.p63可正向调控intronic miR-944表达,反过来miR-944又可促进多个细胞中host gene p63的表达。在NSCLC组织中两者表达高度正相关,表明miR-944与host gene p63基因间存在相互的正反馈调节机制。3.YAP1蛋白在肺腺癌组织中的表达显著高于肺鳞癌,而P63蛋白作为鳞癌标记分子主要表达于肺鳞癌中,两者表达呈显著负相关关系。敲低细胞中YAP1或TAZ表达可促进p63基因表达,提示YAP1/TAZ对p63基因表达的抑制作用。4.mi R-944可抑制YAP1或TAZ表达,解除YAP1/TAZ对p63基因的抑制作用。miR-944—YAP1/TAZ—p63通路是Intronic mi R-944促进其host gene p63表达的机制之一。5.miR-205-5p与miR-944在肺鳞癌中表达显著高于肺腺癌,两者联合检测在手术切除新鲜组织、石蜡组织中均可作为肺鳞癌与腺癌鉴别的重要标记分子。尤其在支气管灌洗液标本中,miR-205-5p与mi R-944联合检测不仅可以提高肺癌的诊断率,同时可以区分肺鳞癌与腺癌组织学类型,具有重要的临床意义。