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目的骨形态发生蛋白2/7异源二聚体(Heterodimeric bone morphogenetic protein 2/7,rhBMP2/7)具有高效的骨诱导活性,而全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)可抑制细胞成骨分化。在成骨分化过程中,rhBMP2/7异源二聚体可显著拮抗ATRA对成骨分化的抑制作用,促进成骨分化。本研究旨在检测rhBMP2/7和(或)ATRA对于细胞破骨分化及破骨活性影响的综合效应,从而评价rhBMP2/7及ATRA在修复骨缺损过程中的综合作用。方法1细胞增殖检测。RAW264.7细胞接种经受体活化核因子κB配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导24h,在RANKL存在的同时加入不同浓度的rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L),诱导培养1、3、5、7天后按试剂盒的使用说明进行Alamar Blue细胞增殖检测。2 TRAP染色及形态学分析。细胞接种后经50ng/mL RANKL诱导24h,随后在RANKL存在的同时加入不同浓度的rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L)刺激培养7天,根据TRAP染色试剂盒的使用说明进行TRAP染色,然后随机采集各个培养孔TRAP染色后的图像并记录,同时对分化成熟的破骨细胞的总表面积、破骨细胞的数目、破骨细胞的平均表面积进行半定量分析。3 TRAP活性检测。细胞接种后经50ng/mL RANKL诱导24h,随后在RANKL存在的同时加入不同浓度的rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L)诱导培养,分别于诱导培养后1-7天按照TRAP活性检测试剂盒进行TRAP活性。4破骨分化特异性基因表达检测。应用实时荧光定量PCR检测rhBMP2/7、ATRA对破骨细胞分化相关基因的表达的影响。将经50ng/mL RANKL诱导24h的RAW264.7细胞培养液中加入rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)±ATRA(1μmol/L),于第1、4、7天提取各组细胞总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR,进行Calcr、Acp5及Ctsk基因表达的检测分析。5破骨细胞钙盐吸收功能检测。细胞接种在孔板底部覆盖一层磷酸钙盐涂层的破骨细胞活性分析基质板(Osteoclast Activity Assay Substrate plates,OAAS,OCT USA,Inc.)上,50ng/mL RANKL诱导24h后,加入含不同浓度的rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)±ATRA(1μmol/L)的RANKL诱导培养,连续培养7天后,光学显微镜下各组孔板中的钙盐吸收陷窝,并随即采集各组孔板钙盐吸收情况的图片,用Image-Pro Plus 6.0软件对所采集照片中OAAS板上各组钙盐吸收的陷窝的面积进行测定,并进行半定量分析。结果1细胞增殖检测。rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L)诱导培养1天后,单独rhBMP2/7诱导组和单独1μmol/L ATRA诱导组及二者联合诱导组均未明显影响细胞增殖,与空白对照组均无显著性差异;第3天时5ng/mL及50ng/mL rhBMP2/7均可促进细胞增殖,且单独5ng/mL rhBMP2/7诱导组与空白对照组无统计学差异,而单独50ng/mL rhBMP2/7诱导组细胞增殖量约为空白对照组细胞量的1.2倍(P<0.0001);单独ATRA诱导组与空白对照组相比则表现为明显的抑制作用,且两组间具有显著的统计学差异(P<0.0001);rhBMP2/7与ATRA联合应用时,无论rhBMP2/7浓度高低,ATRA均可以显著抑制细胞增殖,且与单纯ATRA诱导组无显著差异,而与空白对照组均存在明显的统计学差异,即无论是否存在rhBMP2/7,1μmol/L ATRA均可以明显抑制细胞增殖(P<0.0001),且ATRA可抑制50ng/mL rhBMP2/7对细胞增殖的促进作用;在第5天和第7天,两种浓度的rhBMP2/7对细胞增殖的影响均不明显,但无论是否添加rhBMP2/7,1μmol/L的ATRA仍可显著抑制细胞增殖(P<0.0001)。2 TRAP染色及形态学分析。rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L)诱导培养7天后,空白对照组及单独rhBMP2/7诱导组均可观察到分化成熟的破骨细胞,并随rhBMP2/7浓度的升高,成熟破骨细胞数增多,而1μmol/L ATRA诱导组仅当rhBMP2/7浓度为50ng/mL时偶见分化成熟的破骨细胞,而单独1μmol/L ATRA诱导组及5ng/mL rhBMP2/7与1μmol/L ATRA联合诱导组几乎不可见分化成熟的破骨细胞;对各组TRAP染色图像进行半定量分析,结果显示5ng/mL rhBMP2/7及50ng/mL rhBMP2/7诱导组的分化成熟的破骨细胞表面积均显著高于空白对照组,且与空白对照组相比具有统计学差异;同时随rhBMP2/7浓度的升高,破骨细胞表面积增加显著,而1μmol/L ATRA诱导组无论是否添加rhBMP2/7,其与空白对照组及单独rhBMP2/7诱导组均有显著统计学差异;各实验组破骨细胞数的统计趋势与各组成熟破骨细胞总面积的统计趋势类似,但单独5ng/mL rhBMP2/7诱导组的细胞数目与空白对照组无明显统计学差异;而通过对各组成熟破骨细胞平均面积的统计发现,单独rhBMP2/7诱导组与空白对照组间均无统计学差异。3 TRAP活性检测。在rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L)诱导培养下,空白对照组以及rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)诱导组的细胞TRAP活性从第1天至第7天呈线性增加,但从第4天左右开始,5ng/mL、50ng/mL rhBMP2/7单独诱导组TRAP活性低于空白对照组,而第7天时,空白对照组TRAP活性与rhBMP2/7诱导组相近;而1μmol/L ATRA诱导组,无论是否添加rhBMP2/7,自第3天起其细胞TRAP活性均显著低于非ATRA诱导组,即1μmol/L ATRA能够降低TRAP活性的表达。4破骨分化特异性基因表达检测。rhBMP2/7(5ng/mL或50ng/mL)和(或)ATRA(1μmol/L)诱导培养第1天时,ATRA及rhBMP2/7均未显著影响Calcr、Acp5及Ctsk基因的表达;但在第4天和第7天,空白对照组及单独rhBMP2/7诱导组中三种基因的表达均较第1天显著上调,而1μmol/L ATRA诱导组中三种基因的表达均较空白对照组及相应单独rhBMP2/7诱导组显著降低,并具有统计学差异。5破骨细胞钙盐吸收功能检测。与空白对照组相比,随rhBMP2/7浓度的增高,单独rhBMP2/7诱导组的钙盐吸收陷窝逐渐增多,并且面积逐渐增大,与空白对照组相比有统计学差异,且50ng/mL rhBMP2/7诱导组的钙盐吸收陷窝面积显著高于5ng/mL rhBMP2/7诱导组;而1μmol/L ATRA诱导组无论是否添加rhBMP2/7均无明显钙盐吸收陷窝。结论1 ATRA可明显抑制小鼠来源破骨前体细胞RAW264.7细胞增殖、TRAP活性、破骨基因表达及钙盐吸收能力;2 rhBMP2/7显著促进破骨分化及破骨活性,并随rhBMP2/7浓度的升高作用增强;3 ATRA可显著下调rhBMP2/7所诱导的破骨细胞增殖、TRAP活性、破骨相关基因的表达及钙盐吸收能力。实验表明,ATRA抑制rhBMP2/7诱导的破骨细胞分化及破骨活性。前期实验发现rhBMP2/7可拮抗ATRA对成骨细胞分化的抑制作用,因而ATRA与rhBMP2/7的联合应用可能成为治疗破骨细胞过度活跃诱导的骨丧失疾病的新方法,如炎症诱导的严重骨质疏松症和骨转移引起的骨质流失等。