本课题旨在通过基因克隆和异源表达的方法，获得由特定基因所表达的重组细胞色素P450药物代谢酶，为以后的酶活性鉴定和酶代谢功能研究奠定基础。 1.目的基因的克隆与重组病毒的构建分别以国外获赠的含有CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因的质粒为模板进行PCR扩增目的基因，同时以人肝细胞cDNA为模板PCR扩增CYP2C9基因。对于CYP1A2和CYP2E1，分别在5’端添加EcoRⅠ酶切位点，3’端添加KpnⅠ酶切位点，对于CYP2C9和CYP3A4，分别在5’端添加SalⅠ酶切位点，3’端添加KpnⅠ酶切位点。将目的基因克隆至pCMV-Myc载体上并进行DNA测序，结果证实已获得完整正确的目的基因。将经过双酶切的目的基因片段插入经同样双酶切后的pFastBacl转座载体中，重组质粒转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，转座后产生重组粘粒DNA(Bacmid)。将该重组粘粒转染Sf9细胞后，即产生重组杆状病毒。 2.重组蛋白表达将重组杆状病毒以0.01-0.1的MOI值感染生长良好的Sf9细胞来扩增重组病毒，使病毒滴度达到108pfu/mL，或更高，然后将重组病毒以MOI值5感染Sf9细胞，表达目的蛋白。收集表达72h后的Sf9细胞，经超声破碎及离心后得到含重蛋白的溶解液。测定蛋白浓度。 3.重组蛋白表达分析Western Blot结果显示CYP1A2、CYP2C9重组蛋白分别能与羊抗人CYP1A2、CYP2C9多克隆抗体特异性结合，这表明CYP1A2、CYP2C9基因正确插入表达载体中得到正确表达。SDS-PAGE电泳结果可见CYP1A2、CYP2C9蛋白重组CYP2E1蛋白和重组CYP3A4蛋白表达条带，表明CYP2E1、CYP3A4基因得到正确表达。 综上所述，本实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)分别表达了人CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4重组酶，其中CYP1A2和CYP2C9经过Western Blot鉴定，结果正确。CYP2E1和CYP3A4经过蛋白电泳检测结果正确。本实验为以后的酶活性鉴定和酶代谢功能研究奠定基础。