一个水稻类病斑突变体的鉴定及初步研究

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植株在无任何逆境、机械损伤、病原菌入侵等的情况下,叶片、茎等部位自发的产生类病斑,类似于病原菌侵染下产生的坏死斑,人们将能产生这一表型的突变体统称为类病斑突变体(lesion mimic mutants,LMM)。研究表明大多数水稻类病斑突变体在类病斑产生的过程中,常常伴随着抗病性的增强,因此类病斑突变体是研究植物细胞程序性死亡及抗病机理的理想材料。实验室前期通过甲基磺酸乙酯(Ethylmethane sulfonate,EMS)诱变籼稻品种黄华占获得了一个类病斑突变体,暂命名为spl41,初步分析表明其LOC_Os01g25450基因ATG上游第523个碱基由G突变为A,该单碱基突变可能是造成类病斑表型产生的原因。对该突变体进行了表型鉴定、生理生化指标测定、抗性鉴定、启动子活性和功能分析等实验,取得的主要研究结果如下:突变体spl41从三叶期开始产生红褐色坏死斑,随着生长发育逐渐扩散至整个叶片。与野生型相比,spl41突变体的株高、穗长、分蘖数、千粒重及结实率均显著下降。突变体spl41随着类病斑数目的增加光合色素含量逐渐下降;突变体spl41的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、水分利用效率均低于野生型的水平,表明突变体坏死斑的形成影响了植株叶片的光合作用;透射电镜观察发现突变体spl41叶绿体在逐渐降解,类囊体排列紊乱且数量减少,暗示spl41植株发生了早衰。台盼蓝、NBT和DAB染色表明突变体spl41病斑部位有大量的死亡细胞并伴随着H2O2及O2-的积累;spl41叶片中SOD、CAT和POD的酶学活性均高于野生型;表明spl41中存在大量ROS的积累。苯胺蓝染色表明突变体spl41叶肉细胞中存在着胼胝质的大量积累。突变体spl41能显著提高对白叶枯病、稻瘟病和细菌性条斑病的抗性,q RT-PCR分析表明PR1b、PR3、PR4、PR5、PBZ1和Cht1等病程相关基因在突变体spl41中表达量上调,说明spl41的防御反应被激活。为探究spl41启动子的表达活性,构建p1391Z-spl41promoter-GUS,p1391Z-WT promoter-GUS载体,农杆菌介导法转化拟南芥及水稻。GUS染色结果表明突变体spl41启动子的2020bp能驱动后续基因的表达。为找寻引起spl41产生类病斑表型基因的功能区域,克隆该基因的启动子及部分基因编码序列,农杆菌介导法转化水稻,观察其表型。结果表明spl41自身启动子加上4800bp的编码基因序列并不是使突变体产生红褐色坏死斑的完整序列。接下来还需进一步克隆spl41基因序列,确定该基因互补类病斑表型的功能区。以上结果表明,突变体spl41在类病斑产生的过程中伴随着植株的早衰,活性氧的爆发,并且能显著提高对水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌及稻瘟病菌的抗病性。spl41启动子能够驱动后续GUS基因的表达,为进一步对类病斑基因的克隆及抗病分子机制研究打下了基础。
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