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骨关节炎(osteoarthritis,OA)是膝关节疾病中一种最常见的疾病类型,其特征是关节软骨的逐渐退化。据统计,超过80%的中老年人患有不同程度的骨关节炎,因缺乏有效的临床干预手段,严重降低了人们的生活质量,加重了社会的经济负担。目前OA的具体发病机制还不明确,有证据表明,骨关节炎与软骨病理密切相关,其中包括软骨细胞的肥大分化和纤维化分化。在OA进程中,透明软骨向肥大软骨和纤维化软骨细胞分化,诱导软骨基质降解、软骨内血管入侵和骨刺形成。另外,关节软骨细胞的去分化通常发生在体外培养和扩增的过程中,其特点是Ⅱ型胶原(collage typeⅡ,COL-Ⅱ)的丢失和Ⅰ型胶原(collage type Ⅰ,COL-Ⅰ)的增加。当软骨细胞作为种子细胞用于软骨组织工程时,表型不稳定和容易获得成纤维细胞样表型严重影响软骨修复的结果。综上所述,如何抑制软骨细胞肥大和软骨细胞纤维化分化是OA治疗和软骨组织工程中备受关注的问题。积雪草酸(Asiatic acid,AA)是一种从积雪草中分离得到的五环三萜类化合物,具有多种药理作用,包括抗氧化、抗炎、保肝等作用。最近的研究表明,AA可抑制心肌肥厚和肝纤维化。然而,AA是否能缓解关节软骨细胞的肥大分化或纤维化分化尚未见报道。因此我们提出假设:AA缓解软骨细胞肥大化或软骨细胞纤维化分化。为了验证这一假设,我们设计了如下的实验。方法:我们选用人OA软骨细胞作为研究对象,将软骨碎屑消化后提取细胞进行培养,为了保证软骨细胞的表型,我们选用第1代人OA软骨细胞进行实验。1.首先通过CCK-8试剂盒和死活染色检测不同浓度AA(0、5、10和20μM)对人OA软骨细胞活性的影响,筛选出合适的药物实验浓度。2.人OA软骨细胞分为对照组(control)和实验组(AA)。为观察AA对软骨细胞肥大化表型的影响,使用免疫荧光、定量即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)确定软骨细胞肥大相关因子Runx2、MMP-13和COL-Ⅹ的相关表达,同时,碱性磷酸酶染色也用于ALP的表达。3.为观察AA对软骨细胞纤维化表型的影响,我们使用免疫荧光、qRT-PCR和Western blot法检测纤维化相关因子COL-Ⅰ和α-SMA的表达。4.为观察AA对软骨表型的影响,我们使用免疫荧光、qRT-PCR和Western blot法检测成软骨相关因子SOX9、COL-Ⅱ和aggrecan(ACAN)的表达变化。同时,阿尔新蓝染色也用于检测ACAN的表达。5.在体外,我们进一步使用Western blot法探讨了AA抑制软骨细胞肥大化和纤维化的相关机制。6.最后,我们在进行前交叉韧带切除(ACLT)的大鼠OA模型中进行膝关节注射AA进一步验证AA对于软骨细胞肥大化和纤维化的影响。结果:1.从CCK-8和死活染色结果来看,我们发现浓度为5μM与未处理组相比没有明显差异。然而,10μM和20μM处理后出现更多的细胞死亡。因此,我们选用5μM作为后续的实验浓度。2.我们发现AA处理显著降低软骨细胞肥大相关因子的表达。在人OA软骨细胞中,AA处理降低了Runx2和MMP-13蛋白的表达。qRT-PCR结果显示,AA组Runx2和COL10a1的m RNA水平低于control组,但无统计学差异;AA组MMP-13mRNA水平明显低于control组(p<0.01)。Western blot结果进一步显示,AA组与control组相比,Runx2、MMP-13、COL-X蛋白水平均有不同程度的降低。此外,与对照组相比,AA处理后ALP染色较弱。ALP的降低进一步证实了AA缓解软骨细胞肥大分化的作用。3.我们发现AA降低软骨细胞纤维化相关因子的表达。免疫荧光结果表明相对于control组,AA组的COL-Ⅰ和α-SMA表达减弱。AA组的COL1a1 mRNA水平显著降低了50%,α-SMA mRNA显著降低了22%。Western blot检测结果发现相对于对照组,AA组COL-Ⅰ和α-SMA蛋白水平也显著降低。4.我们进一步分析了AA处理对软骨细胞表型的影响。结果表明,AA组ACAN、COL-Ⅱ、SOX9的免疫荧光染色与对照组相比无差异。基因表达水平上,AA组COL2a1、ACAN、SOX9基因表达明显高于对照组,但AA组与control组的蛋白表达水平相似。control组与AA组阿尔新蓝染色也无明显差异。5.我们在体外发现AA处理后激活了蛋白激酶(AMPK),抑制了磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路。6.体内实验结果表明,AA注射4周、8周后,与ACLT+AA组相比,ACLT组出现软骨侵蚀、细胞明显减少、大量蛋白多糖丢失,OARSI评分较高。组织化学结果分析显示,与ACLT组相比,ACLT+AA组COL-Ⅱ表达增加,肥大化和纤维化表达物表达降低,这些结果提示AA在骨关节炎发生发展过程中减缓了软骨细胞的肥大化和纤维化分化,与我们的假设一致。结论:AA可通过靶向AMPK/PI3K/AKT信号通路,减少软骨细胞的肥大化和纤维化,维持关节软骨的成软骨表型。我们的研究表明,AA可能是一个有前景的药物成分,以抑制软骨细胞的肥大化和纤维化为目标治疗OA。