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研究目的：1.观察RGC-32在单核细胞向巨噬细胞分化以及巨噬细胞极化过程中的表达,探讨调控巨噬细胞RGC-32表达的因素。2.观察RGC-32表达对巨噬细胞分泌IL-6、TGF-β、IL-1β和TNF-α等炎症因子的影响,探讨RGC-32调控巨噬细胞分泌炎症因子的分子机制。研究方法：1.以单核细胞系THP-1细胞为研究对象,分别在转录水平和蛋白水平检测THP-1细胞在向巨噬细胞分化及巨噬细胞极化过程中RGC-32的表达THP-1细胞在含有10Ong/ml的PMA培养基中诱导培养,48小时后诱导分化为巨噬细胞。THP-1细胞在含100ng/ml的PMA培养基中诱导6小时,然后加入100ng/ml的LPS和20ng/ml的IFN-γ或20ng/ml的IL-4培养42小时后,分别极化为M1型或M2型THP-1巨噬细胞。在单核细胞系向THP-1巨噬细胞诱导的第0、6、12、24和48小时,分别采用荧光定量PCR和western-blot检测RGC-32在巨噬细胞中的表达。取THP-1细胞和THP-1巨噬细胞进行免疫荧光染色,采用荧光显微镜观察RGC-32在巨噬细胞中的表达和定位。提取THP-1巨噬细胞、M1和M2型THP-1巨噬细胞的总RNA和蛋白,分别采用荧光定量PCR和western-blot检测RGC-32在THP-1巨噬细胞、M1和M2型THP-1巨噬细胞的表达。2.人CD14+细胞的分离和培养,探讨单核细胞向巨噬细胞分化及巨噬细胞极化过程中RGC-32的表达取健康志愿者的外周血、结肠癌患者的外周血和腹水,密度梯度离心法获取单个核细胞,采用CD14+磁珠阳性筛选获得外周血单核细胞或CD14+肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)。纯化后的外周血单核细胞在含有100ng/ml的M-CSF和10%胎牛血清的培养基中诱导培养。诱导7天分化为巨噬细胞,加入LPS和IFN-γ继续培养2天,极化为M1型巨噬细胞,而巨噬细胞加入IL-4继续培养2天,极化为M2型巨噬细胞。采用荧光定量PCR法检测单核细胞向巨噬细胞分化及巨噬细胞极化过程中RGC-32 mRNA的表达水平。3.以单核细胞系THP-1细胞为研究对象,探讨在巨噬细胞极化过程中调控RGC-32的因子分别采用标准浓度的LPS配合梯度浓度的IFN-γ或标准浓度的IFN-γ配合梯度浓度的LPS诱导THP-1细胞系极化为M1型THP-1巨噬细胞,采用梯度浓度的IL-4诱导THP-1细胞极化为M2型THP-1巨噬细胞,荧光定量PCR法检测GC-32 mRNA的表达水平,以确定在巨噬细胞极化过程中LPS、IFN-γ和IL-4对RGC-32表达的影响。4.以单核细胞系THP-1细胞为研究对象,采用siRNA和逆转录病毒转染技术沉默和过表达THP-1细胞中RGC-32以HiPerFect Transfection为载体转染siRNA干扰THP-1细胞中RGC-32的表达。取THP-1细胞经PBS洗涤后,加入无血清RPM11640培养基。将细胞分为阴性载体对照组1、阴性载体对照组2和干扰组,分别加入HiPerFect Transfection、阴性对照siRNA和RGC-32siRNA,孵育12小时后,加入l00ng/ml的PMA,继续培养48小时后收集细胞,提取总蛋白,用vestern-blot检测不同实验组中RGC-32蛋白的表达水平,计算RGC-32的沉默效率。逆转录病毒载体转染THP-1细胞过表达RGC-32。取THP-1细胞经PBS洗涤后,将含有pBMN-GFP和pBMN-GFP-RGC-32上清液加入至THP-1细胞的培养体系中,逆转录病毒感染THP-1细胞。感染THP-1细胞后经100ng/ml的PMA处理48小时,收集细胞并提取总蛋白,用western-blot检测不同实验组中RGC-32蛋白的表达水平。5.RGC-32沉默或过表达对巨噬细胞细胞因子mRNA的表达和分泌的影响PMA诱导沉默和过表达RGC-32的THP-1细胞48小时后分化为巨噬细胞,收集细胞并提取总RNA,用荧光定量PCR检测巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-p mRNA的表达水平。分化的巨噬细胞用PBS洗3次,继续培养48小时,收集细胞培养上清,高速离心后采用ELISA检测培养上清中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-p的浓度。6.探讨RGC-32调控巨噬细胞分泌细胞因子IL-6的分子机制采用P13K抑制剂LY294002或对照DMSO预处理siRGC-32和siRNA的THP-1细胞60min, PBS洗涤后,采用PMA刺激48小时诱导分化为巨噬细胞。PBS洗3次,继续培养48h,收集细胞培养上清,高速离心后采用ELISA检测培养上清中细胞因子IL-1p、IL-6、TNF-α和PTGF-p的分泌水平。分别收集siRGC-32和siRNA的巨噬细胞提取总蛋白后,采用western-b lot技术检测AKT磷酸化蛋白水平。结果：1.RGC-32在单核细胞向巨噬细胞分化过程中呈诱导性表达,巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化过程中RGC-32表达下调,向M2型极化过程中表达上调荧光定量PCR和western-blot结果显示,THP-1细胞向THP-1巨噬细胞分化过程中,RGC-32呈诱导性表达。免疫荧光检测显示,RGC-32表达于THP-1细胞和THP-1巨噬细胞的细胞浆,且RGC-32在THP-1巨噬细胞表达的荧光强度明显高于THP-1细胞。THP-1巨噬细胞经LPS和IFN-γ刺激极化为M1型THP-1巨噬细胞,RGC-32的表达显著地降低。而巨噬细胞经IL-4刺激极化为M2型THP-1巨噬细胞,RGC-32的表达上调。人单核细胞向巨噬细胞分化及巨噬细胞极化过程中RGC-32的表达趋势与单核细胞系一致。2.在M1型巨噬细胞中,LPS抑制RGC-32表达,而在M2型巨噬细胞中IL-4促进RGC-32的表达采用浓度梯度的IFN-y与标准的LPS诱导巨噬细胞向M1极化,结果显示RGC-32mRNA的表达水平在各组之间无显著差异。采用浓度梯度的LPS与标准的IFN-γ诱导巨噬细胞极化,随着LPS浓度的增高,RGC-32 mRNA的表达水平逐渐降低。利用浓度梯度的IL-4诱导巨噬细胞向M2极化,结果显示随着IL-4浓度的升高,RGC-32 mRNA的表达水平逐渐增高。3.在TAMs中RGC-32的表达受肿瘤微环境中M-CSF和IL-4所调控TAMs起源于外周血单核细胞,被肿瘤细胞和基质细胞募集到肿瘤部位。磁珠分选分离转移性结肠癌腹水中CD14+TAMs,采用荧光定量PCR检测RGC-32在TAMs中的表达较单核细胞明显增高。这提示由肿瘤释放的细胞因子可能参与上调RGC-32表达。我们应用M-CSF和IL-4特异性抗体封闭转移性腹水中M-CSF和1L-4,然后将封闭后腹水加入到单核细胞培养体系中,结果显示RGC-32的表达明显降低。4.以HiPerFect Transfection为载体转染siRNA干扰或逆转录病毒感染能有效地沉默或过表达THP-1巨噬细胞中RGC-32的表达以HiPerFect Transfection为载体转染siRNA干扰THP-1细胞,然后诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,检测干扰RGC-32表达效率。结果显示,siRGC-32能有效干扰巨噬细胞RGC-32蛋白的表达。逆转录病毒感染THP-1细胞,诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,采用、vestern-blot检测RGC-32过表达的效率。结果显示,在巨噬细胞中逆转录病毒感染能有效地过表达RGC-32。5. RGC-32可抑制巨噬细胞分泌IL-6,促进TGF-p的产生siRGC-32及对照siRNA转染巨噬细胞,提取细胞总RNA和收集培养上清,分别采用荧光定量PCR和ELISA检测巨噬细胞表达和分泌IL-6、TGF-βIL-1β和口TNF-α的水平。结果显示,RGC-32干扰可促进巨噬细胞IL-6,抑制TGF-β的表达和分泌,但不影响IL-1β和TNF-α的表达和分泌。提取过表达RGC-32的巨噬细胞及对照巨噬细胞总RNA和收集细胞培养上清,结果显示RGC-32的表达可抑制巨噬细胞IL-6,促进TGF-p的表达和分泌,但不影响IL-1β和TNF-α。6.RGC-32通过抑制PI-3K信号通路从而促进巨噬细胞IL-6的分泌PI-3K信号通路参与调节IL-6的分泌。分别在0、12、24和48小时收集PMA诱导的THP-1细胞,提取总蛋白,western-blct检测到磷酸化的AKT显著增加,48小时后达到峰值,而总AKT没有变化。采用LY294002预处理THP-1细胞,PMA诱导THP-1细胞分化为THP-1巨噬细胞,ELISA检测LY294002显著地抑制巨噬细胞分泌IL-6,对巨噬细胞分泌TGF-β无显著影响。分别比较LY294002预处理siRGC-32和对照siRNA的巨噬细胞,两者分泌IL-6的水平无显著差异。除此之外,western-blot检测到siRGC-32的巨噬细胞AKT磷酸化水平较对照组显著地升高,而总AKT无明显变化。免疫共沉淀技术检测RGC-32与AKT存在相互作用关系。结论：1.在THP-1向巨噬细胞分化过程中,RGC-32的表达水平明显增加。在巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化过程中,LPS明显地下调RGC-32的表达。在向M2型巨噬细胞极化过程中IL-4明显地上调RGC-32的表达。2.RGC-32通过PI-3K信号通路抑制巨噬细胞IL-6的分泌。