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目的:血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是高度恶性肿瘤中存在的由肿瘤细胞通过自身变形和细胞外基质重塑所形成的血管样管道。近年来,越来越多的研究发现恶性肿瘤的生长、转移、侵袭和复发与肿瘤VM的形成密切相关。膜型1基质金属蛋白酶（Membrane type 1 matrix metalloproteinases,MT1-MMP）作为基质金属蛋白酶类中的一员在恶性肿瘤的生长、侵袭、转移及复发中具有重要的作用。局部黏着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）属于蛋白酪氨酸激酶,能够改变细胞与细胞外基质的粘附性,促进肿瘤细胞的移动、浸润、侵袭及转移。本实验通过建立人卵巢癌细胞株HO8910裸鼠异种移植瘤模型,给予顺铂（Cisplatin,DDP）最大可耐受剂量化疗（maximum tolerated dose chemotherapy,MTD）及低剂量节拍化疗（low-dose metronomic chemotherapy,LDM）,观察LDM-DDP模式下荷人卵巢癌细胞HO8910裸鼠移植瘤模型VM生长变化情况,并检测MT1-MMP及FAK的表达水平,探讨LDM对卵巢癌裸鼠移植瘤中VM的影响及可能机制。方法:1建立裸鼠移植瘤模型并分组化疗:体外培养HO8910细胞,将1×107细胞重悬于0.2ml PBS中,接种到6-8周龄的雌性裸鼠大腿外侧皮下,建立裸鼠异体移植瘤模型。10天后随机把81只裸鼠分成三组,每组为27只:顺铂最大可耐受剂量（MTD-DDP）组,顺铂3mg/kg,1次/3日,腹腔注射,共6次;顺铂低剂量节拍化疗（LDM-DDP）组,顺铂1mg/kg,1次/日,腹腔注射,共18次;对照组,腹腔注射等量的生理盐水。2获取肿瘤样本:给药期间仔细观察裸鼠的一般情况及肿瘤的生长情况,每隔1天测量一次裸鼠的皮下移植瘤体积。根据计算机生成的随机数表,从化疗开始后每隔1天各组随机抽取3只裸鼠采用戊巴比妥过量麻醉处死,在无菌条件下剥离裸鼠皮下移植瘤,将获取的肿瘤样本从中间切开,一半固定于4%多聚甲醛中,一半存放于-80℃冰箱中。每次获取9个肿瘤样本,至化疗结束共9次,共获取肿瘤样本81个。化疗结束后分别计算MTD-DDP组及LDM-DDP组的抑瘤率。3免疫组织化学双重染色:将固定于4%多聚甲醛中的肿瘤样本进行石蜡包埋、组织切片,采用CD31/PAS双重染色,观察VM的表达情况。划分中央区和外周区,分别在显微镜下连续计数10个肿瘤组织高倍视野（×400）下的VM,取其均值作为VM密度。4应用免疫组织化学SP法染色和Western Blot的方法检测MT1-MMP和FAK在移植瘤中的表达水平。结果:1裸鼠皮下移植瘤生长情况自化疗开始,MTD-DDP组、LDM-DDP组及对照组三组裸鼠皮下移植瘤体积一直处于不断增大的状态,化疗结束时各组移植瘤体积均比化疗开始时增大(PMTD-DDP组=0.002,PLDM-DDP组<0.001,P对照组=0.001)。至化疗结束,MTD-DDP组及LDM-DDP组移植瘤的体积均小于对照组（P=0.042,P<0.001）,而LDM-DDP组移植瘤体积又小于MTD-DDP组（P=0.009）。MTD-DDP组抑瘤率为10.48%,LDM-DDP组抑瘤率为31.14%。2 CD31/PAS双重染色下的VM形态经过CD31/PAS的双重染色,在显微镜低倍镜下看到VM和内皮依赖性血管共存于移植瘤中,内皮依赖性血管多位于移植瘤周边,并可见其与宿主组织相交,而VM多位于移植瘤中央区。换成高倍镜,各组移植瘤中均可见到樱桃红色的PAS阳性管道,部分管道的外层为CD31染色呈阴性的肿瘤细胞,PAS阳性血管样图案呈直线状、平行状、交叉状、环状、网状等多种形状,管壁薄厚不一,部分管腔中可见到红细胞。3不同化疗模式下VM在移植瘤中的生长变化情况1)不同化疗模式下裸鼠移植瘤中央区VM的生长变化MTD-DDP组、LDM-DDP组及对照组三组移植瘤中央区均可观察到VM,且在化疗第2天三组移植瘤中VM密度差异不具有统计学意义（P=0.468,P=0.472,P=0.359）。随着移植瘤的增长,VM密度在各组移植瘤中央区均呈现先增多后减少的变化趋势。对照组中的VM密度从第2-8天呈现逐渐增加的趋势,第9-18天逐渐减少。两化疗组不同于对照组,第2-10天递增,11-18天递减。从化疗开始到第8天,对照组中VM密度与MTD-DDP组比较差异没有统计学意义（P2=0.810,P4=0.479,P6=0.363,P8=0.822,均P>0.05）。从第10天至化疗结束,MTD-DDP组移植瘤中央区的VM密度大于对照组,差异具有统计学意义(P10=0.037,P12=0.018,P14=0.014,P16=0.043,P18=0.013,均P<0.05)。LDM-DDP组移植瘤中央区的VM密度从化疗第4天开始均小于MTD-DDP组及对照组,差异具有统计学意义(P4=0.010,P6=0.005,P8=0.013,P10=0.027,P12=0.046,P14=0.006,P16=0.005,P18=0.006,均P<0.05)。2)不同化疗模式下裸鼠移植瘤外周区VM的生长变化情况在卵巢癌裸鼠移植瘤的外周区也出现了VM。与中央区相似,三组移植瘤外周区中的VM密度也呈现先递增后递减的趋势。化疗第2天,三组移植瘤中的VM密度差异均无统计学意义（P=0.893,P=0.667,P=0.598）。MTD-DDP组与对照组移植瘤中的VM密度从化疗开始至第10天逐渐增大,之后呈现下降的趋势。LDM-DDP组移植瘤外周区的VM密度在化疗第12天时出现峰值,并开始递减。从第2天至第8天,MTD-DDP组的VM密度与对照组比较差异没有统计学意义（P2=0.998,P4=0.424,P6=0.236,P8=0.231,均P>0.05）,从第10天至化疗结束,MTD-DDP组的VM密度大于对照组,两两比较差异均具有统计学意义(P10=0.037,P12=0.010,P14=0.014,P16=0.043,P18=0.013,均P<0.05)。LDM-DDP组移植瘤外周区的VM密度从化疗第4天至化疗结束明显小于MTD-DDP组和对照组(P4=0.009,P6=0.001,P8=0.013,P10=0.027,P12=0.003,P14=0.006,P16=0.034,P18=0.008,均P<0.05)。3)移植瘤中央区与外周区VM密度的比较从化疗开始至结束,三组移植瘤外周区和中央区的VM密度均呈现先增多后减少的趋势,化疗第10天左右出现峰值,说明此时移植瘤中的VM密度最大。三组移植瘤中央区的VM密度分别大于外周区的VM密度,差异均有统计学意义（均P<0.05）。4移植瘤中MT1-MMP及FAK的表达在显微镜下观察发现,通过免疫组织化学SP法染色,VM周围部分肿瘤细胞中可见MT1-MMP及FAK抗原的表达,而远离VM的区域不达或较少表达MT1-MMP和FAK抗原。1)MT1-MMP蛋白的表达情况在化疗第2天,三组移植瘤中央区有少量MT1-MMP蛋白表达,三组比较差异无统计学意义（P=0.184,P=0.417,P=0.417）。化疗第10天,MTD-DDP组的MT1-MMP蛋白表达高于对照组（P=0.002）,LDM-DDP组MT1-MMP蛋白表达明显低于对照组（P<0.001）。化疗第18天,MTD-DDP组的MT1-MMP蛋白表达高于对照组（P=0.004）,LDM-DDP组MT1-MMP蛋白表达低于对照组（P=0.002）。外周区MT1-MMP蛋白的表达与中央区相似,在化疗开始,三组移植瘤中央区有少量MT1-MMP蛋白表达,三组比较差异无统计学意义（P=0.326,P=0.710,P=0.184）。化疗第10天,MTD-DDP组的MT1-MMP蛋白表达高于对照组（P=0.004）,LDM-DDP组MT1-MMP蛋白表达明显低于对照组（P=0.009）。化疗第18天,MTD-DDP组的MT1-MMP蛋白表达高于对照组（P=0.016）,LDM-DDP组MT1-MMP蛋白表达低于对照组（P=0.018）。2)FAK的表达情况在化疗开始,三组移植瘤中央区有少量FAK蛋白表达,三组比较差异无统计学意义（P=0.082,P=0.196,P=0.420）。化疗第10天,MTD-DDP组的FAK蛋白表达水平比对照组高（P=0.001）,LDM-DDP组FAK蛋白表达水平明显比对照组低（P=0.002）。化疗第18天,MTD-DDP组的FAK蛋白表达水平比对照组高（P=0.008）,LDM-DDP组FAK蛋白表达水平明显比对照组低（P=0.004）。外周区FAK蛋白的表达与中央区相似,在化疗开始,三组移植瘤中央区有少量FAK蛋白表达,三组比较差异无统计学意义（P=1.000,P=0.482,P=0.573）。化疗第10天,MTD-DDP组的FAK蛋白表达比对照组高（P=0.021）,LDM-DDP组FAK蛋白表达水平明显比对照组低（P=0.004）。化疗第18天,MTD-DDP组的FAK蛋白表达水平比对照组高（P=0.009）,LDM-DDP组FAK蛋白表达水平明显比对照组低（P=0.006）。结论:1化疗药物累计剂量相同时,LDM模式比MTD模式具有更好的抑制荷人卵巢癌HO8910细胞裸鼠皮下移植瘤生长的效果。2卵巢癌HO8910细胞裸鼠皮下移植瘤中可以形成VM,其形成随时空变化存在一定的规律。LDM模式可以抑制VM的形成而MTD模式可以促进VM的形成。LDM模式可能在肿瘤生成的早期,并且对分化程度低、侵袭性高的肿瘤作用效果更好。3 LDM模式下卵巢癌移植瘤中MT1-MMP和FAK的表达显著的低于MTD模式,提示LDM模式可能通过抑制MT1-MMP及FAK的表达而减少VM的形成,进而抑制肿瘤的生长、侵袭、转移及复发。