背景毛囊是具有周期性生长特性的一个特殊器官,毛囊周期分为生长期、退化期和静止期。在静止期,毛囊细胞受到某些因素的刺激,会再次进入生长期,如此周而复始在哺乳动物的整个生命期间循环往复。毛囊经历生长期、退化期、静止期循环后再次进入生长期的过程称为毛囊周期性再生。由于毛囊具有周期性生长的特性,为组织再生研究提供了一个非常好的模型。如果毛囊各周期转换中的任何一个环节出现问题,就可能会影响毛囊的生长,进而出现毛囊相关疾病,例如脱发、斑秃等。而斑秃等的治疗在机制研究和临床研究上还存在诸多问题,如容易复发等。因此,毛囊周期的调控就显得至关重要,毛囊周期由毛囊干细胞介导发生。毛囊干细胞的激活和静息受到多种信号通路的调控,包括Wnt信号通路、BMP信号通路、FGF信号通路、Shh信号通路等。Wnt信号通路广受关注,它分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路,在毛囊的发育和周期性再生中发挥着重要的调控作用。经典Wnt信号通路研究较多,在经典Wnt信号通路的各个重要环节进行阻断,均会严重影响毛囊的生成。激活Wnt信号通路的Wnt蛋白有19种,但在毛囊周期性再生中,哪种或哪几种发挥关键作用,还不得而知。作者通过文献筛选,发现Wnt10b在皮肤附件发育时具有最明显的限制性表达,即特异性地表达于毛囊发育早期的基板。而毛囊的周期性再生过程与毛囊发育具有相似性,因此,作者推测Wnt10b在毛囊周期调控中发挥着重要作用。目的与意义本课题拟研究Wnt10b在毛囊周期调控中发挥的具体作用,并探讨其作用机制。为研究基于Wnt蛋白的治疗毛囊周期性再生障碍相关疾病的药物提供基础。材料与方法1. Wnt10b在毛囊周期中的表达观察①用免疫组化的方法观察Wnt10b蛋白在小鼠生后正常周期毛囊中的表达特性,并采用免疫印迹方法对小鼠各周期中皮肤全层Wnt10b的表达进行半定量分析;②制备地高辛标记的Wnt10b RNA探针,观察Wnt10bmRNA在小鼠生后正常周期毛囊中的表达状况,并采用逆转录PCR的方法对小鼠各周期中皮肤全层Wnt10b的mRNA表达进行半定量分析。2. Wnt10b对毛囊的作用研究①利用HEK-293细胞扩增,CsCl超速离心纯化AdWnt10b,验证腺病毒介导目的基因的生物学活性;②解剖显微镜分离触须毛囊,建立器官培养模型,并通过荧光染色对模型进行评价,然后用AdWnt10b处理培养毛囊,离体观察Wnt10b对毛囊的影响;③在小鼠背部皮内注射腺病毒,并通过直接观察荧光、X-gal染色等方法对动物模型进行评价,然后在不同时相点注射AdWnt10b,在体观察Wnt10b对毛囊的影响。3. Wnt10b的信号通路研究①用免疫组化检测正常毛囊周期中经典Wnt信号通路中的关键分子Frizzled、Lef1、TCF3的蛋白表达,并分别通过原位杂交和免疫组化对β-catenin的原位mRNA和蛋白表达进行检测,与Wnt10b的表达情况进行对比,进一步利用PCR array技术,检测毛囊不同周期Wnt信号分子间的表达差异;②在毛囊器官培养模型上,利用腺病毒载体从细胞膜受体水平、细胞浆水平和细胞核转录水平分别阻断经典Wnt信号通路的关键分子后,观察其对AdWnt10b诱导毛干生长作用的影响;③静止期小鼠拔毛诱导毛囊生长,然后利用腺病毒载体从细胞膜受体水平、细胞浆水平和细胞核转录水平分别阻断经典Wnt信号通路的关键分子,观察毛囊生长情况;在以上各在体动物注射模型上,利用腺病毒介导的β-catenin干扰序列干扰经典Wnt信号通路后,观察其对Wnt10b诱导毛囊周期性再生作用的影响。4.Wnt10b在毛囊周期中的作用机制研究①通过BrdU标记检测Wnt10b诱导后不同时相点皮肤及毛囊细胞的增殖情况;②通过免疫荧光和免疫印迹研究Wnt10b在JB6细胞系中过表达后对细胞分化的影响。结果与讨论1. Wnt10b表达与毛囊周期具有时空相关性Wnt10b蛋白和mRNA在静止期无表达,在退化期的近心端(靠近真皮一端)内外根鞘有弱表达,在生长期的毛母质强表达,生长期的内外根鞘及前体细胞也有表达。说明Wnt10b与毛囊周期密切相关,可能在毛囊的周期性再生中发挥重要的调控作用。2. Wnt10b能够诱导毛囊周期性再生本实验所扩增的腺病毒具有生物学活性;研究发现经AdWnt10b处理的器官培养毛囊,其毛干生长的速度明显比对照组快,此离体说明Wnt10b对毛囊生长有促进作用;用AdWnt10b注射小鼠背皮后,能够在注射部位观察到绿色荧光,说明该腺病毒能够用于在体皮内注射;注射AdWnt10b后,生长期和退化期的毛囊无变化,而静止期毛囊提前进入生长期,此在体说明Wnt10b能诱导毛囊周期性再生。3. Wnt10b经由经典Wnt信号通路发挥诱导毛囊周期性再生作用检测正常毛囊周期中经典Wnt信号通路中关键分子Frizzled、Lef1、TCF3的蛋白表达,并对β-catenin的原位mRNA和蛋白表达进行检测,发现它们与Wnt10b的表达相关联。进一步通过PCR array分析也发现,生长期的经典Wnt信号分子显著高于静止期和退化期;在毛囊器官培养模型上,阻断经典Wnt信号通路关键分子后,能够阻断AdWnt10b诱导毛干生长的作用,此离体研究说明Wnt10b经由经典Wnt信号通路促进毛干生长;在体动物注射模型上,干扰经典Wnt信号通路关键分子β-catenin后,能够阻断AdWnt10b诱导毛囊周期性再生的作用,此在体研究说明Wnt10b经由经典Wnt信号通路诱导毛囊的周期性再生。4. Wnt10b可能通过诱导表皮基底层细胞增殖、分化而启动毛囊周期性再生BrdU标记检测增殖发现Wnt10b诱导后24h,表皮基底层细胞最先发生增殖,然后全层皮肤和毛囊细胞发生增殖。提示Wnt10b可能通过直接或间接作用于表皮基底层细胞,来发挥诱导毛囊周期性再生的作用; Wnt10b诱导表皮基底层细胞表达毛囊结构的标记物,说明Wnt10b可能通过诱导表皮基底层细胞增殖,并向毛囊细胞分化而诱导毛囊周期性再生,但推论是否成立还需要后续实验进一步研究。结论本研究首次发现Wnt10b能够诱导毛囊周期性再生,并证实其通过经典Wnt信号通路,即Wnt10-Frizzled-β-catenin-LEF/TCF信号链来发挥调控作用;在过表达的情况下,表皮基底层细胞可能是Wnt10b作用的靶细胞,但还需要进一步研究。