论文部分内容阅读
背景与目的淋巴道转移常于肺腺癌早期发生,是导致肺腺癌患者预后不佳的重要因素。作为一种大分子多糖,透明质酸(hyaluronan,HA)广泛存在于包括肺腺癌在内的多种肿瘤基质,主要通过淋巴系统回吸收。研究表明,HA参与了肺腺癌等多种肿瘤细胞增殖、黏附、迁移和侵袭,并可能促进肿瘤细胞经淋巴道转移。Layilin是一种近来报道的特异性HA受体。在发现Layilin表达于肺腺癌A549细胞的前期工作基础上,本研究拟构建能表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的质粒载体,以抑制Layilin表达,进而检测对A549细胞体外增殖、黏附、迁移和其裸鼠移植瘤生长及经淋巴道转移的影响,并观察是否能延长荷瘤小鼠的生存期。研究方法设计和构建能表达针对Layilin mRNA的siRNA的RNA干扰载体(Layilin siRNA Vector)和表达不针对任何已知人类mRNA的siRNA的RNA干扰阴性对照载体(Control siRNA Vector),分别通过脂质体介导转染至A549细胞。经G418筛选(500μg/mL)并稳定传代后,用半定量RT-PCR、Real time RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测未转染质粒的A549细胞(A549-nontransfection)、转染了Layilin siRNA Vector的A549细胞和转染了Control siRNA Vector的A549细胞中Layilin mRNA和蛋白表达,筛选Layilin表达受抑制的A549细胞(A549-siLayilin)和Layilin表达未受影响的RNA干扰阴性对照A549细胞(A549-siControl)。针对体外培养的A549-nontransfection(非转染组)、A549-siLayilin(RNA干扰抑制组)和A549-siControl(RNA干扰阴性对照组)三组细胞,分别采用细胞锚定增殖分析、软琼脂集落形成实验、平板黏附模型、划痕“愈合”模型和Boyden chamber模型,检测在HA存在或不存在条件下,它们体外增殖、黏附、迁移和侵袭能力的差异。针对A549-nontransfection(非转染组)、A549-siLayilin(RNA干扰抑制组)和A549-siControl(RNA干扰阴性对照组)三组细胞种植裸鼠形成的移植瘤,分别采用背部皮下种植侵袭模型和爪垫皮下种植淋巴结转移模型,检测它们生长、侵袭和经淋巴道