论文部分内容阅读
目的马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)是青霉菌属中唯一温度依赖的双相性条件致病菌,它能在免疫缺陷人群(尤其是HIV感染患者)中引起严重的系统性青霉病(Penicilliosis marneffei, PSM)。PM致病机制有待深入研究。随着PM基因组测序的完成,有必要建立一个高通量的基于同源重组进行定点PM基因敲除方法以用于PM致病机制研究。在真核生物中,外源DNA整合到基因组中是通过两种DNA双链断裂(DNA double strand breaks, DSB)修复机制：同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)。基于已知哺乳动物细胞中参与非同源末端连接DNA双链断裂(DNA double strand breaks, DSB)修复途径的蛋白有ku70、ku80、DNAPKcs、LIG4和XRCC4,通过抑制非同源末端连接DNA双链断裂(DNA double strand breaks, DSB)修复途径提高基因打靶效率的方法在丝状真菌中已经建立。本课题通过基因敲除技术构建马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)的LIG4同源基因缺失突变体以提高基因打靶效率,为通过基因打靶方法深入研究PM致病分子机制提供一个有力的遗传操作工具。方法通过在马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)基因组数据库中查找LIG4同源基因,设计特异PCR引物扩增其两侧同源序列并通过融合PCR方法将筛选标记基因pyrG插入两侧同源序列之间构建PMlig4同源基因缺失载体,将该基因缺失载体转化入马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)尿嘧啶营养缺陷型菌株SPM4(pyrG,niaD-)原生质,筛选阳性克隆,提取转化子DNA,再通过PCR技术验证获得LIG4同源基因缺失株。将得到的LIG4同源基因缺失株与原始研究出发菌株SPM4比较,观察表型并进一步实验验证其同源重组效率。结果以粗糙脉孢菌(Neuospora crassa) LIG4蛋白序列进行Blastp比对发现马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM) LIG4同源蛋白由1005个氨基酸残基组成,与粗糙脉孢菌(Neuospora crassa) LIG4蛋白序列有66%相似性和51%一致性。两个蛋白均具有保守的BRCT结构域、DNA结合部位和DNA连接酶Ⅳ活性部位。编码PM的LIG4基因全长ORF共3018bp,共有外显子3个,内含子2个。用融合PCR成功构建了以pyrG为筛选标记基因的PMlig4同源基因敲除载体,用已构建好的含pyrG基因马尔尼菲青霉菌PMlig4基因缺失载体遗传转化马尔尼菲青霉菌尿嘧啶营养缺陷菌株SPM4原生质体,筛选到尿嘧啶营养缺陷得到互补的转化子154个,制备基因组DNA并用PCR方法筛选鉴定到PMlig4基因缺失突变株12株。结论本课题通过融合PCR方法成功构建了含pyrG筛选标记基因的马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM) LIG4同源基因缺失载体,并成功将该基因缺失载体转化入菌株SPM4(pyrG-, niaD-)原生质,成功构建得到了马尔尼菲青霉菌LIG4同源基因缺失突变体,为进一步验证该突变株在基因打靶遗传操作中的高效性并利用其进行马尔尼菲青霉菌基因功能和致病分子机制研究打下了良好的基础。