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研究背景:痤疮的发病机制一般认为毛囊皮脂腺导管的异常角化、皮脂腺功能亢进、痤疮丙酸杆菌及微生物感染等。尽管5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)能有效治疗痤疮的疗效已经获得确认,但是其作用机制尚并未完全清楚,除了人们熟悉的杀菌、抗炎、抑制皮脂腺分泌外,还可能同时作用于角质形成细胞的过度角化及增殖过程。目的:本研究基于以上背景,拟首先采用经典兔耳痤疮动物模型,在体外试验中验证ALA-PDT疗法对毛囊皮脂腺导管过度角化有抑制作用;随后以成纤维生长因子-10(Fibroblast Growth Factor 10,FGF-10)诱导的 HaCaT 细胞(人永生化角质形成细胞系)过度角化及增殖模型为研究对象,检测ALA-PDT干预前后HaCaT增殖水平及K1、K6、K16蛋白表达水平的变化,检测其分泌细胞因子IL-1α的水平,以及检测加用PKCa(PKC激动剂)或PKCi(PKC抑制剂)后ALA-PDT对PKC信号通路的作用。明确ALA-PDT疗法通过PKC信号通路对其增殖和角化过程的影响。研究方法:1.体内实验及检测项目1.1实验动物及分组 雌性家兔兔耳构建兔耳痤疮模型,将实验动物随机分为4组:①空白对照组;②油酸组;③ALA-PDT组;④油酸后使用ALA-PDT组。每组5只雌兔。1.2粉刺大小 皮肤镜检测粉刺直径1.3 HE染色 观察各组雌兔粉刺中毛囊导管角化的情况。1.4免疫组化 检测雌兔皮肤K1、K6、K16、PKC的表达情况。2.体外实验及检测项目2.1细胞培养HaCaT由江苏省人民医院皮肤科实验室提供。37℃,5%CO2条件下用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。2.2实验细胞分组2.2.1 FGF-10构建过度角化及增殖模型,将实验随机分为4组:①空白对照组;②FGF-10组;③ALA-PDT组;④FGF-10后使用ALA-PDT 组。2.2.2 将实验随机分为4组:①空白对照组;②FGF-10组;③FGF+ALA-PDT 组;④FGF-10+ALA-PDT+PKCa 组;⑤FGF-10+ALA-PDT+PKCi 组2.3细胞增殖活性 CCK-8法检测细胞增殖活性。2.4过度角化及过度增殖相关蛋白检测 Western Blot和免疫荧光法检测过度角化相关蛋白K1和过度增殖蛋白K6、K16。2.5细胞因子IL-1α检测 RT-PCR和ELISA分别检测细胞IL-1α mRNA和IL-1α蛋白表达情况。2.6 PKC通路相关蛋白检测 Western Blot和免疫荧光法检测PKC蛋白及下游相关蛋白K1、K6、K16的表达情况。结果:1.体内实验结果1.1 ALA-PDT对油酸所致兔耳粉刺增大有抑制作用皮肤镜检测显示,与对照组相比,油酸组粉刺直径增加,差别有统计学意义,而单纯ALA-PDT对粉刺无明显改变。ALA-PDT则可改善油酸所致痤疮粉刺,使粉刺直径下降。1.2 ALA-PDT对油酸所致兔耳毛囊导管口阻塞过度有抑制作用HE染色显示,与对照组相比,油酸组毛囊导管口阻塞过度,而单纯ALA-PDT对毛囊导管口多度角化无明显改变。ALA-PDT则可改善油酸所致毛囊导管口阻塞过度。1.3 ALA-PDT对油酸所致兔耳皮损K1、K6和K16表达量增多有抑制作用免疫组化结果显示,与对照组相比,油酸组中K1、K6和K16表达量明显上升,差别有统计学意义。而单纯外用ALA-PDT对K1、K6和K16表达量无明显改变。外用ALA-PDT则可改善油酸所致K1、K6和K16表达量上升。2.体外实验结果2.1 ALA-PDT对FGF-10所致HaCaT过度增殖有抑制作用CCK8结果显示,与对照组相比,FGF-10组细胞增殖活性明显上升,差别有统计学意义。ALA-PDT则可改善FGF-10所致细胞增殖活性上升。2.2 ALA-PDT对FGF-10所致HaCaT细胞K1、K6、K16表达量增加有抑制作用Western blot和免疫荧光结果显示,与对照组相比,FGF-10组细胞K1、K6、K16蛋白表达量明显上升,差别有统计学意义。ALA-PDT则可改善FGF-10所致细胞K1、K6、K16蛋白表达量上升。2.3 ALA-PDT对FGF-10所致HaCaT细胞IL-1α表达量增加有抑制作用RT-PCR和ELISA结果显示,与对照组相比,FGF-10组细胞IL-1α mRNA和蛋白表达量明显上升,差别有统计学意义。ALA-PDT则可改善FGF-10所致IL-1 α mRNA和蛋白表达量上升。2.4 ALA-PDT对FGF-10诱导HaCaT细胞其PKC通路的表达有抑制作用CCK-8 结果显示,与 FGF+ALA-PDT 组相比,FGF+ALA-PDT+PKCa 组细胞增殖活性明显上升,而FGF+ALA-PDT+PKCi组细胞增殖活性明显下降,差别有统计学意义。Western blot和免疫荧光结果分别显示,与FGF+ALA-PDT组相比,FGF+ALA-PDT+PKCa组细胞K1、K6、K16、PKC蛋白表达量明显上升,而FGF+ALA-PDT+PKCi组细胞K1、K6、K16、PKC蛋白表达量明显下降,差别有统计学意义。RT-PCR和ELISA结果分别显示,与FGF+ALA-PDT 组相比,FGF+ALA-PDT+PKCa 组细胞 IL-1α mRNA 和蛋白表达量明显上升,而FGF+ALA-PDT+PKCi组细胞IL-1α mRNA和蛋白表达量明显下降,差别有统计学意义。结论:本文的研究证实,在体内外实验中,5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)抑制角质形成细胞过度角化及增殖。5-氨基酮戊酸光动力疗法可减轻粉刺增大,角质形成细胞过度角化,可能与调控PKC通路和角化及增殖相关的K1、K6、K16从而发挥抑制过度角化和增殖的作用。