目的:杜鹃素是来源于中药兴安杜鹃（Rhododendron dauricum L.）叶中的一种二氢黄酮类生物活性成分,有祛痰止咳的功效,此外其还具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤和抑制血管平滑肌细胞增殖等生物活性。本课题组前期研究显示杜鹃素对氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡以及紧密连接损伤具有保护作用。然而,与杜鹃素所介导内皮细胞保护作用相关的作用机制和作用靶标仍有待进一步阐明。Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2）-ARE（Antioxidant response element）通路是细胞氧化应激反应中的关键通路,介导众多抗氧化酶和II相解毒酶的表达。近期研究表明,GSK-3β（Glycogen synthase kinase 3β）是独立于Keap1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1）的Nrf2负调控因子。本论文第一部分首先探索并鉴定杜鹃素与EA.hy926血管内皮细胞的特异性亲和蛋白,并进一步研究其与亲和蛋白（GSK-3β）的相互作用及对激酶活性的抑制作用;第二部分研究杜鹃素对EA.hy926细胞Akt/GSK-3β/Nrf2/ARE氧化应激信号通路的调节作用,阐明其抵抗氧化应激损伤潜在的分子信号机制和作用靶标;第三部分采用酶促动力学以及分子对接和分子动力学技术,在分子水平阐释杜鹃素与GSK-3β蛋白的作用位点和作用模式。本文通过上述研究旨在揭示杜鹃素在血管内皮细胞中潜在的作用靶点,进一步明确其对细胞氧化应激通路的调控作用,最终阐明杜鹃素发挥氧化损伤保护作用的具体作用机制。方法:1、采用药物亲和反应靶点稳定性技术（Drug affinity responsive target stability,DARTS）与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术联用的方法检测杜鹃素在EA.hy926血管内皮细胞中的特异性亲和蛋白。设置杜鹃素与细胞总蛋白裂解液共孵育组和空白溶剂处理对照组,各组蛋白样品经链霉蛋白酶裂解后,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,考马斯亮蓝染色,对差异蛋白条带进行LC-MS/MS检测,经数据库检索鉴定差异蛋白。2、利用DARTS与Western blot技术联用的方法,验证差异蛋白GSK-3β与杜鹃素的亲和力。进一步采用细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）与Western blot技术联用的方法检测杜鹃素与发现的差异蛋白GSK-3β的亲和力。设置杜鹃素与细胞总蛋白裂解液共孵育组和空白溶剂处理对照组,各组蛋白样品经不同温度加热处理后,离心沉降聚沉的蛋白,Western blot方法检测各组蛋白样品中前述发现的差异蛋白GSK-3β的含量。3、采用生物膜干涉技术（Biolayer interferometry,BLI）对杜鹃素与GSK-3β的结合动力学过程进行实时监测,检测二者的结合特异性,并使用ForteBio Data Analysis软件计算结合解离常数。4、采用Kinase-Glo Luminescent Kinase方法检测杜鹃素对GSK-3β激酶活性的抑制作用,确定杜鹃素对GSK-3β激酶活性抑制作用的量效关系,并通过非线性回归分析方法计算IC₅₀值。5、Western blot法检测杜鹃素对EA.hy926细胞中抗氧化应激核转录因子Nrf2核转移水平以及下游抗氧化酶:血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）的表达量的影响。采用RT-PCR技术检测杜鹃素对EA.hy926细胞中抗氧化酶相关基因Nrf2、HO-1和NQO1表达量的影响。6、采用MTT法和细胞免疫荧光法检测氯化锂（LiCl,GSK-3β抑制剂）对杜鹃素介导的血管内皮细胞保护活性和Nrf2核转移水平的影响。7、采用Western blot法检测杜鹃素对EA.hy926细胞中GSK-3β、p-GSK-3β（Ser9）、p-GSK-3β（Thr390）、Akt和p-Akt表达量的影响。8、利用siRNA技术沉默EA.hy926细胞中Nrf2的表达,采用Western blot法检测Nrf2沉默效率以及沉默后杜鹃素对细胞中GSK-3β、p-GSK-3β（Ser9）、p-GSK-3β（Thr390）、HO-1和NQO1表达量的影响。采用MTT法检测Nrf2沉默对杜鹃素介导的血管内皮细胞保护活性的影响。采用流式细胞术检测内皮细胞中Nrf2沉默后,杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞内活性氧（ROS）水平的影响。9、利用siRNA技术沉默EA.hy926细胞中GSK-3β的表达,采用Western blot法检测GSK-3β沉默效率以及沉默后杜鹃素对细胞中Nrf2核转移水平以及HO-1和NQO1表达量的影响。采用MTT法检测GSK-3β沉默对杜鹃素介导的血管内皮细胞保护活性的影响。采用流式细胞术检测内皮细胞中GSK-3β沉默后,杜鹃素对过氧化氢（H₂O₂）诱导损伤的EA.hy926细胞内ROS水平的影响。10、采用ADP-Glo Kinase方法对杜鹃素抑制GSK-3β激酶活性的酶促动力学过程进行测试,通过绘制Lineweaver-Burk双倒数图确定杜鹃素抑制GSK-3β激酶活性的机制。11、采用分子对接（Autodock）和分子动力学（GROMACS）及结合自由能计算（MM-PBSA）技术分析阐明杜鹃素与GSK-3β的结合位点和作用模式。结果:1、杜鹃素处理组与空白溶剂处理对照组间存在的差异蛋白条带经LC-MS/MS鉴定,根据Protein_Qscore以及蛋白分子量等条件进行筛选,共鉴定得到3个可能的差异蛋白,结合文献资料分析,最终判定具有后续研究价值的差异蛋白为GSK-3β。2、DARTS结合Western blot技术实验结果显示,在蛋白:裂解酶（pronase）比例（m:m,质量比）为100:1和200:1时,随着杜鹃素浓度升高,GSK-3β条带逐渐增强,显示出更高的对抗蛋白酶解的稳定性。CETSA与Western blot技术联用实验结果表明,杜鹃素处理组GSK-3β蛋白条带显示出更高的热稳定性,并且随着杜鹃素浓度升高,GSK-3β条带逐渐增强。3、BLI实验结果表明杜鹃素与GSK-3β的结合显示出明确的浓度依赖性,其平衡解离常数（K_D）值为6.338×10^-4 mol/L。4、Kinase-Glo Luminescent Kinase法筛选GSK-3β激酶抑制活性结果显示,杜鹃素对GSK-3β激酶活性的抑制行为具有显著的剂量依赖性,IC₅₀值为27.14±1.08μmol/L。5、Western blot和RT-PCR检测结果表明,杜鹃素在10、20、40和80μmol/L浓度范围内时明显促进Nrf2向细胞核内转移,并诱导HO-1和NQO1在转录水平和蛋白水平表达升高,呈明显的剂量依赖关系;且在1、3、6、12和24 h时间点内对HO-1和NQO1在转录水平和蛋白水平的表达具有诱导作用,具有明确的时效关系。6、MTT法测定结果显示,LiCl提高了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护率。细胞免疫荧光法显示,LiCl对杜鹃素诱导的Nrf2核转移具有促进作用。7、Western blot结果表明,杜鹃素在1、3、6、12和24 h时间点内对GSK-3β和p-GSK-3β（Thr390）的蛋白表达量无明显影响,而在12和24 h时间点内促进p-GSK-3β（Ser9）的表达升高;并且杜鹃素在10、20、40和80μmol/L浓度范围内时对GSK-3β和p-GSK-3β（Thr390）的蛋白表达量无明显影响,但能够促进p-GSK-3β（Ser9）的表达升高,具有明确的量效关系。此外杜鹃素在10、20和40μmol/L浓度范围内时对Akt的蛋白表达量无明显影响,但能够促进p-Akt的表达,具有明确的量效关系。8、MTT法测定结果显示,Nrf2沉默降低了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护率。流式细胞术检测结果表明,Nrf2沉默升高了H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞内ROS水平,并且抑制了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞内ROS水平的下调作用。Western blot结果显示,利用siRNA技术沉默EA.hy926细胞中Nrf2的表达对GSK-3β、p-GSK-3β（Ser9）、p-GSK-3β（Thr390）的蛋白表达水平无显著影响,使HO-1和NQO1的蛋白表达水平降低。9、MTT法测定结果显示,GSK-3β沉默升高了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护率。流式细胞术检测结果表明,GSK-3β沉默降低了H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞内ROS水平。Western blot结果显示,利用siRNA技术沉默EA.hy926细胞中GSK-3β的表达后,HO-1和NQO1的蛋白表达水平升高,Nrf2核转移水平增强,并且促进了杜鹃素诱导的HO-1蛋白表达水平升高和Nrf2核转移水平。10、ADP-Glo Kinase法进行激酶酶促动力学测试结果显示,杜鹃素呈ATP竞争性抑制GSK-3β的激酶活性。11、分子对接结果显示杜鹃素可与GSK-3β在其ATP结合口袋内与Ile62,Glu97,Val135和Phe201等形成氢键,与Lys85形成pi-cation相互作用。分子动力学模拟对分子对接结果的合理性和可靠性进行验证,并进一步表明杜鹃素与Val135,Asp200及Ile62形成的氢键可稳定存在,而杜鹃素与Lys85形成pi-cation相互作用较弱。通过运用MM-PBSA方法计算得到杜鹃素与GSK-3β的结合自由能为-65.236±10.563 kJ/mol。结合过程的主要贡献能量为van der Waals energy、electrostatic energy和SASA（solvent accessible surface area）energy。结论:1、杜鹃素可与GSK-3β特异性的结合,并呈ATP竞争性抑制GSK-3β的激酶活性。2、杜鹃素促进核转录因子Nrf2入核,上调其下游抗氧化相关靶基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表达水平。此外,siRNA介导的Nrf2沉默降低了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护作用。表明杜鹃素可诱导激活EA.hy926细胞Nrf2-ARE抗氧化应激信号通路,进而发挥对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护作用。3、除直接作用于GSK-3β并抑制其激酶活性外,杜鹃素还可以促进Akt的磷酸化,进而诱导Nrf2负调控因子GSK-3β的9位Ser抑制性磷酸化水平升高。此外,GSK-3β抑制剂LiCl预处理提高了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护作用以及Nrf2核转移水平,并且siRNA介导的GSK-3β沉默促进了杜鹃素诱导的Nrf2-ARE抗氧化应激信号通路的激活,增强了杜鹃素对H₂O₂诱导损伤的EA.hy926细胞保护作用,证明Nrf2负调控因子GSK-3β的活性抑制是杜鹃素激活Nrf2-ARE抗氧化应激信号通路发挥内皮细胞保护作用中的必须环节。4、杜鹃素可在GSK-3β的ATP结合口袋内,通过氢键作用与GSK-3β结合形成复合物,该过程在热力学上是可自发进行的。