随着感染性眼病的控制，视网膜色素变性已经成为主要的致盲性眼病之一，其发病率约1/4000，全球患病者超过一百万。虽然针对病因的基因治疗是解决问题的根本，但由于RP的高度遗传异质性，使得针对特定基因的治疗手段不具有普遍性。而由于细胞凋亡已被证实为不同遗传型RP中感光细胞死亡的共同通路。因此，抗凋亡治疗成为RP治疗的有力的作用位点。 米诺环素是属于四环素家族的广谱、二代半合成抗菌素，近年来由于在其药效学上的新发现而受到神经科学者的关注。人们首先注意到米诺环素的抗炎作用：对脑缺血性病变，米诺环素的应用可减轻病灶处小胶质细胞的活化和聚集。进一步的研究表明，米诺环素对慢性神经变性性疾病也具有治疗作用，主要表现为抑制神经细胞的凋亡。鉴于大量动物模型的研究基础，以及米诺环素多年来在抗菌方面的应用经验，目前已经展开了针对肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化和亨廷顿病的临床试验。一些前期的小样本研究表明米诺环素是安全并且有效的。 睫状神经营养因子最初是从鸡的眼球抽提物中分离出来的一种能促进鸡胚睫状神经节细胞存活的蛋白质。研究发现，CNTF对多种神经元均具有保护作用。对于其作用机制，目前仍未能确定。已经提出的理论包括：抑制谷氨酸的兴奋性毒性；调节神经胶质细胞；活化神经保护信号转导通路等。 为评估米诺环素是否具有对视网膜感光细胞的保护作用，本研究首先观察米诺环素对体外培养的视网膜原代神经细胞凋亡的作用，再以视网膜变性的动物模型--视网膜慢变性小鼠作为研究对象，观察米诺环素治疗的效果。此外，我们还尝试将外源性的神经保护药物与内源性的神经营养因子结合应用，即在使用米诺环素的同时，通过基因转移增加CNTF的表达。比较联合治疗与单纯米诺环素应用的效果，分析联合治疗的可行性和必要性。 第一部分视网膜神经细胞培养及凋亡模型的建立 目的：原代培养视网膜神经细胞，建立神经细胞凋亡模型。 材料和方法：取生后7天SD乳鼠，摘取眼球后分离视网膜，胰酶消化后接种于包被多聚赖氨酸的培养皿中。接种次日加入阿糖胞苷抑制胶质细胞生长。细胞生长5～7日行免疫组化鉴定，分别检测NSE、Rhodopsin、GFAP和Lectin的表达。神经细胞凋亡模型采用1000M和1mM的谷氨酸诱导，MTT法检测细胞存活率。以AnnexinV/PI的流式细胞仪检测评估细胞凋亡。 结果：接种24小时后，大部分细胞贴壁生长。绝大部分细胞呈近圆形，胞体较小，折光性好。另可见小部分细胞呈不规则形，胞体大而扁平，生长于第一类细胞的下方。经免疫组化鉴定，前者为神经细胞，后者为神经胶质细胞。通过两种抗体的双染，可见神经细胞中大部分为视杆细胞。培养细胞中约80％为视杆细胞；10％为神经胶质细胞，偶见小胶质细胞。100μM和1mM的谷氨酸都可引起细胞的死亡，MTT法得到的光密度均值：正常对照组，0.093±0.008；低浓度谷氨酸组，0.043±0.006；高浓度谷氨酸组，0.037±0.008。正常组与两个谷氨酸组之间存在显著性差异，两个谷氨酸组之间不存在显著性差异。采用1mM谷氨酸作用1小时后，AnnexinV/PI检测可见凋亡细胞比例由0.3％升高至7.7％。 结论：采用酶消化法原代培养视网膜细胞，并以阿糖胞苷抑制神经胶质细胞，可得到以神经细胞为主的视网膜细胞。100μM和1mM谷氨酸均可有效诱发凋亡，其中1mM谷氨酸作用1小时后，即可检测到神经细胞凋亡显著增多。 第二部分米诺环素对体外培养视网膜神经细胞的抗凋亡作用 目的：观察米诺环素对抗谷氨酸诱导的神经细胞凋亡的效果，分析其作用机制。 方法：原代培养视网膜神经细胞，分为正常对照组、米诺环素对照组、谷氨酸对照组和米诺环素治疗组。干预1小时后行AnnexinV/PI流式细胞仪检测，计数凋亡细胞数量；RT-PCR检测caspase-3的mRNA水平，流式细胞仪检测Rh123评估线粒体膜电位。干预12小时后行MTT检测细胞活性；取细胞培养上清做一氧化氮合酶(NOS)的活力单位检测。 结果：干预1小时后，AnnexinV/PI流式细胞仪检测凋亡细胞比例：正常对照组，5.1％；米诺环素对照组，4.3％；谷氨酸对照组，15.2％；米诺环素治疗组，8.3％。Caspase3各组水平：正常对照组，0.28±0.07；米诺环素对照组，0.36±0.06；谷氨酸对照组，0.92±0.11；米诺环素治疗组，0.58±0.08。干预12小时后，MTT检测各组细胞吸光度均值：正常对照组，0.093±0.008；米诺环素对照组，0.099±0.012；谷氨酸对照组，0.0378±0.008；谷氨酸+米诺环素治疗组，0.08775±0.016。经统计，正常组与治疗组之间无显著性差异，谷氨酸对照组与其他各组之间均有显著性差异。流式细胞仪检测Rh123，得出各组阳性率。正常对照组，67.1％；米诺环素对照组，54.2％；谷氨酸对照组，27.5％；米诺环素治疗组，32.4％。NOS活力单位检测，以其他各组与正常组的比值进行统计，均数为：正常对照组，1；米诺环素对照组，0.987±0.219；谷氨酸对照组，1.513±0.472；米诺环素治疗组，1.176±0.259。其中谷氨酸对照组与其他三组之间有显著性差异。 结论：20μM米诺环素可显著减轻谷氨酸诱导的神经细胞凋亡，其作用机制与抑制caspase-3的表达，稳定线粒体膜电位，以及抑制NOS活性有关。 第三部分米诺环素对rds鼠视网膜感光细胞凋亡的拮抗作用 目的：观察米诺环素腹腔注射对视网膜慢变性小鼠视网膜感光细胞凋亡的治疗效果。 材料和方法：实验动物分为3组。米诺环素治疗组与阳性对照组为日龄匹配的rds小鼠。米诺环素组于生后7天开始腹腔注射米诺环素，每日50mg/kg。阳性对照组小鼠不作干预。正常对照组为日龄匹配的C3B小鼠。三组小鼠分别于P18，P25，P35及P45时处死，摘取眼球。检测指标如下：P18的视网膜切片原位细胞凋亡检测；P45的视网膜切片外核层厚度测量；各时间点视网膜切片HE染色；各时间点的视网膜切片F4/80免疫组化检测。 结果： 1.原位细胞凋亡检测：正常对照组视网膜未见阳性细胞。治疗组与阳性对照组的视网膜切片均可在外核层发现阳性染色细胞，治疗组较阳性对照组数量明显减少。 2.形态学观察：正常对照组视网膜各层结构完整，外核层细胞有9～10层，其外侧依次为感光细胞内节与外节。治疗组及阳性对照组视网膜结构相似，各时间点视网膜外节均缺如；外核层细胞层数随小鼠日龄增长逐渐减少。其中阳性对照组由P18的9～10层减少到P45的6～7层；而治疗组视网膜在P45时有7～8层。P45时，距视乳头200μm处ONL厚度：治疗组，40.85±2.89μm；阳性对照组，33.31±4.47μm；正常对照组，48.89±2.18μm。距视乳头600pro处ONL厚度：治疗组，39.90±3.19μm；阳性对照组，28.96±3.34μm；正常对照组，35.62±2.68μm。治疗组与阳性对照组间有显著性差异。 3.视网膜F4/80免疫组织化学检查：正常对照组可见视网膜内层散在阳性细胞。阳性对照组可见分布于视网膜各层的阳性染色，视网膜下腔亦见阳性细胞。治疗组视网膜阳性染色相对较少，大部分局限于视网膜内层，偶见于外丛状层，外核层及视网膜下腔均未见阳性细胞。 结论：米诺环素治疗可减少视网膜慢变性小鼠的感光细胞凋亡数量，延缓外核层变薄的发展。 第四部分米诺环素联合CNTF基因转移对rds鼠感光细胞凋亡的拮抗作用 目的：观察米诺环素与CNTF基因转移联合应用拮抗rds鼠视网膜感光细胞凋亡的效果，并与单纯应用米诺环素的效果进行比较，探讨联合治疗的必要性。 材料和方法：rds小鼠于P7开始每日腹腔注射米诺环素50mg/kg。P10小鼠右眼接受单次的玻璃体腔注射携带睫状神经基因的重组腺相关病毒，作为联合治疗组；左眼不做处理，作为单一治疗组。两组动物分别于P18，P25，P35及P45时处死，摘取眼球。检测指标如下：RT-PCR检测CNTF的mRNA表达；免疫组化检测CNTF在视网膜的表达；P18的视网膜切片原位细胞凋亡检测；P45的视网膜切片外核层厚度测量；各时间点视网膜切片HE染色。 结果： 1.RT-PCR：除P18两组间无显著性差异外，转染AAV-CNTF的联合治疗组CNTF的mRNA表达较单一治疗组显著增高，表明转染的基因在mRNA水平得到有效表达。 2.视网膜CNTF免疫组织化学检查：单一治疗组阳性染色基本见于视网膜内层，其中神经纤维层染色呈短索状，与视网膜平面平行；内丛状层染色呈细条状，与视网膜平面垂直；内核层散在阳性细胞。随时间延长无明显变化。联合治疗组可见视网膜阳性染色分布与单一治疗组相近，但数量较多，且随时间延长逐渐增多，提示CNTF表达大致位于神经胶质细胞，转染后表达增加。 3.P45时，距视乳头200μm处ONL厚度：单一治疗组，40.85±2.89μm；联合治疗组，45.39±3.32μm。距视乳头600μm处ONL厚度：单一治疗组，39.90±3.19μm；联合治疗组，41.48±2.80μm。200μm处两者有显著性差异。 结论：AAV-CNTF转染后可显著提高视网膜CNTF的表达；米诺环素与CNTF联合应用，可有效延缓rds鼠视网膜变性，其效果优于米诺环素单独应用。