目的:人类细胞核内存在着46条致密染色质,它们在不同的基因组尺度下具有不同的染色质折叠,这可能使基因组能够进行有效的组装和功能组织。目前,研究染色质折叠的技术主要有染色质构象捕获(3C)技术和成像技术,但他们大多数只能用于固定细胞的研究。然而,活细胞染色质折叠的研究对于理解染色质时空组织与基因功能的关系至关重要。近年来,CRISPR/Cas9成像技术已经被证明可以有效用于活细胞染色质折叠研究,该技术可以对染色质位点进行活细胞成像。在本课题中,我们构建了多重sgRNA-CRISPR/Cas9系统,目的是利用该系统初步实现染色质位点的成像,并为活细胞染色质折叠的研究提供理论基础。方法:本课题构建质粒的方法有连接、重组、Golden-gate克隆,构建过程中用HiPure Gel Pure Micro Kit(D2111-03)回收凝胶DNA,用HiPure Plasmid Micro Kit C(P1001-03C)提取质粒。采用lipo3000转染细胞,然后利用激光共聚焦显微镜成像观察,最后用ImageJ处理成像数据。结果:1.CRISPR-Cas9双光系统可以实现重复基因组序列的成像。构建CRISPR/Cas9双光系统,包括(CRISPR/Cas9)-(MS2-MCP)与(CRISPR/Cas9)-(PP7-PCP)。虽然利用该系统我们成功实现了端粒及小鼠Dusp5序列的成像,但是由于多种sgRNA无法同时表达,导致非重复基因组序列成像的失败。2.质粒依赖的多重sgRNA组装系统。建立多重sgRNA组装系统,该系统用于组装多种sgRNA到单个质粒,进而提高多种sgRNA同时表达的能力。3.非重复基因组序列的成像。利用多重sgRNA表达质粒实现24种sgRNAs同时表达,进而实现非重复基因组序列的成像。结论:多重sgRNA质粒组装系统的建立可以提高多种sgRNA同时表达的能力,从而提高了sgRNA靶向基因组能力,进而提高了CRISPR成像系统对非重复基因组序列的成像,拓展了CRISPR在基因组成像领域的应用范围,为研究染色质三维组织和动态提供了理论基础。