酶、核酸等生物大分子的分析检测对于探讨生命过程、揭示遗传奥秘等生命科学研究具有重要意义。传统的基于有机染料的荧光分析法面临着Stokes位移小、容易光漂白和生物毒性大等缺点。近年来,纳米技术的蓬勃发展为生物分析领域贡献了多种多样的新型荧光纳米材料,如半导体量子点、上转换荧光纳米材料、荧光金属纳米材料等。其中,核酸稳定的荧光铜纳米颗粒(CuNPs)具有合成简单快速、成本低廉、安全无毒和超大Stokes位移等优点。尤其是单链poly T序列稳定的荧光铜纳米颗粒(polyT-CuNPs),由于在荧光探针设计上的灵活性,现已在生物分析领域崭露头角,引起较大的研究热情。然而在应用中,poly T-CuNPs仍然表现出荧光发射强度相对较弱和荧光稳定性不佳等问题。本论文即瞄准这一前沿研究热点,围绕poly T-CuNPs的荧光性能改善难题,利用其对序列长度的依赖性(其荧光强度与模板序列长度成正比),通过引入末端转移酶(TdT)的免模板聚合性能,构建了基于TdT聚合“超长”poly T介导合成荧光铜纳米颗粒的生物分析技术平台,并在此基础上选择生物酶和核酸为分析对象,进一步结合核酸工具酶和氧化石墨烯的特殊功能,开展了简单、方便、低成本、灵敏、特异且免标记的生物大分子分析研究。具体如下:1.“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒用于DNase Ⅰ的免标记和灵敏分析研究脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)是一种常见的DNA内切酶,在DNA修复、废物管理和细胞凋亡中扮演着重要角色,其活性变化与多种疾病密切相关。本文通过巧妙结合DNase Ⅰ的DNA降解产物带有3’羟基的特点以及TdT仅能识别和延伸3 ’羟基化DNA底物的性能,利用poly T-CuNPs作为信号输出源,首次建立了一种基于“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒的简单、绿色、免标记和高灵敏的DNase Ⅰ活性分析新方法。当DNase Ⅰ存在时,3 ’磷酸化修饰的引物探针可被降解为多条带有3 ’羟基的DNA片段;利用TdT以DNase Ⅰ降解产物为延伸引物在dTTP的底物池中发生聚合反应,即可生成“超长”poly T单链DNA;以该“超长”poly T为模板,即可合成荧光CuNPs作为信号源实现检测DNaseⅠ活性的目的。荧光光谱分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳表征都证实该策略能有效用于缓冲液中DNase Ⅰ的检测。经DNase Ⅰ切割后再经TdT延伸所获得的poly T序列长度远大于500 mer,且以该产物为模板合成的poly T-CuNPs经电镜表征显示,其粒径分布在3-4 nm并具有明显的晶格结构。在对引物浓度、酶工作时间和dTTP浓度等条件进行系统优化后,该策略实现了对DNase Ⅰ的定量分析,线性范围为0.02-2.0 U/mL(R2=0.9928),检测下限达0.02U/mL。同时,选择λ核酸外切酶等6种不同生物酶和蛋白质作为参照物发现,该策略对于DNaseⅠ具有良好的检测特异性。此外,该策略也被应用于实际生物样本(小牛血清)中DNase Ⅰ的检测。该策略有望在分子生物学以及相关的疾病研究中发挥重要作用。2.“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒结合氧化石墨烯用于miRNA的免标记循环放大检测研究微小核糖核酸(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,其异常表达与人类癌症、糖尿病、肝炎等密切相关,因此是用于临床诊断、治疗和预后的理想生物标志物。本文首次将氧化石墨烯(GO)引入“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒信号放大平台,利用GO对单双链核酸的选择性吸附性能以及对所吸附核酸的抗酶切保护作用,进一步结合DNase Ⅰ对DNA和RNA的选择性降解功能,发展了一种设计简单、免于标记、灵敏度高且特异性好的miRNA循环放大检测新方法。具体选择miRNAlet-7a作为模式靶标,首先采用荧光光谱表征考察了GO对单/双链吸附能力的差异,并在此基础上,利用靶miRNA与延伸引物DNA的互补杂交作用,以“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒为信号输出,建立了一种非放大模式miRNA检测方法。该方法显示在5-100 nM(R2=0.9965)范围内有良好的线性相关性,检测最低浓度为5nM。随后进一步引入工具酶DNase Ⅰ,利用其对DNA的选择性降解作用以及GO对表面所附DNA引物的抗酶切保护作用,实现了输出信号的双重放大:第一重放大是通过DNase Ⅰ将目标miRNA从GO上竞争下来的DNA探针降解为多条带有3’羟轻基的DNA片段,由此增加了 TdT延伸底物的浓度,并继而通过TdT聚合“超长”polyT模板实现信号放大;第二重放大则是通过DNase Ⅰ切割使得DNA/miRNA双链解体,进而释放靶标并实现其循环利用,不断将GO表面的DNA探针竞争下来,实现信号放大。结果表明,基于这两重信号放大机制,使得miRNA检测限下降至50pM,检测灵敏度提高了 100倍,并在50pM-10nM(R2=0.9938)范围内显示出良好的线性关系。同时,选择let-7家族中let-7e、let-7d、let-7i以及非同家族的miR-21、miR-222等作为参照物发现,该策略对于let-7a也具有良好的检测特异性。该策略为构建新型免标记RNA检测技术提供了新思路。