研究背景臭氧(Ozone)具有强氧化性,医用臭氧(Medical ozone, O2-O3)是利用医用纯氧制备的臭氧与纯氧的混合气体。与日常生活用和工业用臭氧不同,医用臭氧必须具有很高纯度及03浓度剂量的可控性。臭氧浓度过高,对组织细胞具有强氧化毒性损伤作用；臭氧浓度过低在体内容易被抗氧化物还原,起不到药理学作用。临床常用臭氧浓度为20～50μg/ml。近年,国外通用的医用臭氧发生仪已通过SFDA批准[SFDA (Ⅰ) 20042540177]引进国内临床应用。医用臭氧发展有近50年历史,但我国临床医生对此较陌生。在欧洲等地医用臭氧广泛用于治疗糖尿病足、创伤及皮肤溃疡的愈合、脑中风、溃疡性结肠炎、关节炎、椎间盘突出症等疾病,其临床疗效得到了充分肯定。细菌感染是当今人类面临的常见健康问题,抗生素则是人类对抗细菌的一大革命性发明。抗生素的不恰当使用已经成为很大的社会和经济问题。抗生素如同一把双刃剑,用之科学合理,可以为人类造福,不恰当则会危害人类的健康。青霉素问世后,抗生素成了人类战胜病菌的神奇武器。然而,人们很快发现,虽然新的抗生素层出不穷,但是,抗生素奈何不了的耐药菌也越来越多,耐药菌的传播尤其令人担忧,各种超级细菌层出不穷,严重影响人们的健康和生命。而医用臭氧对细菌高效、广谱、高洁及经济的杀灭作用,为临床治疗细菌感染提供了新的选择。臭氧可有效杀灭或灭活水中及物体表面包括G+或G-菌、真菌、原虫、甲型肝炎病毒(HAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)等多种微生物。目前,多数学者认为臭氧灭活微生物的机制是通过生物化学氧化反应而影响生物细胞中物质的交换。具体灭活机制可能有以下3种形式：①臭氧能氧化分解细菌细胞内部的葡萄糖氧化酶：②臭氧直接与细菌、病毒发生作用,破坏其细胞内DNA和RNA,,分解蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物,使微生物的新陈代谢和繁殖过程遭到破坏：③臭氧能渗透细胞膜组织,侵入细胞膜,穿入菌体内部,作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖,使细胞发生通透性畸变,导致细胞溶解死亡,并且使死亡菌体内的遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、支原体及热原等溶解变性而死亡。臭氧对微生物的杀灭率受温度、接触时间和臭氧浓度等主要因素的影响。医用臭氧对细菌高效、广谱、安全的杀灭特点为临床治疗细菌感染提供了新的选择。既然临床应用臭氧取得了满意的疗效,为什么未见其在临床中推广及应用,根本原因就是臭氧的相关基础研究远远落后于临床实践,许多作用及机制尚未明了,限制了其在临床治疗领域的扩展。臭氧的治疗具有双面性,臭氧的氧化程度与臭氧的浓度呈正比,浓度过低疗效欠佳,浓度过高则对周围组织产生强刺激,甚至导致组织器官的损伤。随着相关基础研究的开展,臭氧治疗已逐渐得到越来越多的医生的重视及应用。但目前关于医用臭氧在何种条件下对各种细菌的杀灭作用较好,对各种不同细菌的杀灭作用是否有差异,作用时间多长对细菌的杀灭效果好,又可以尽可能的减少不良反应,都是臭氧应用于临床需要迫切研究的问题。目前的相关文献报道并不多,本实验研究安全范围内不同浓度、不同作用时间对临床感染常见的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀菌作用,为临床应用医学臭氧提供初步依据。目的1、研究不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用,以及对这两种细菌的杀灭作用是否有区别；2、研究医用臭氧作用时间对细菌的杀灭作用的影响,既可以对细菌有很好的杀灭作用,又能尽可能地减少不良反应；3、为医用臭氧的临床应用提供初步依据。方法取实验菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌于无菌生理盐水制备成菌悬液,麦氏比浊法调整含菌量,以不同浓度医用臭氧在不同时间点分别作用于两种菌悬液,计算两种细菌的杀灭率。数据以x±s表示,采用SPSS13.0软件对数据进行分析,用多因素析因设计方差分析对处理因素和分组作统计分析,用单因素方差分析对同一组间不同浓度或不同时间点的杀菌率进行比较,组内任意两组间差异采用LSD法比较,P<0.05为有统计学差异。结果一、不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌的杀灭率具有显著性差异(F=5278.00,p<0.05),浓度越高对细菌的杀灭率越高,浓度为50μg/ml作用10min对金黄色葡萄球菌的杀灭率为100%。不同浓度医用臭氧对大肠埃希菌的杀灭率具有显著性差异(F=3293.26,P<0.05),浓度越高对细菌的杀灭率越高,浓度为50μg/ml作用10min对大肠埃希菌的杀灭率为100%。二、相同浓度医用臭氧对不同细菌的杀灭作用相同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率具有显著性差异(F=142.88,90.93, p<0.05),30μg/ml以下浓度医用臭氧对大肠埃希菌的杀灭率较金黄色葡萄球菌的杀灭率高,当医用臭氧浓度升至50μg/ml时对两种细菌的杀灭率均为100%三、不同作用时间医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用相同医用臭氧浓度下5min和10min作用时间对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率有明显差异,随作用时间的延长杀菌率增高,作用时间为10min和15min对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均为100%；当医用臭氧浓度升至30μg/ml,作用时间为10min以上时对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均为100%。结论一、体外实验中安全范围内的医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有很好的杀灭作用；提示在体内作用时,可考虑通过提高医用臭氧浓度及延长作用时间,增强杀菌效果。二、医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用与浓度成正比,浓度越高对细菌的杀灭作用越好；三、相同医用臭氧浓度下对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率随作用时间的延长杀菌率增高；四、本研究发现在相同浓度(<30μg/ml)医用臭氧作用下,大肠埃希菌的杀灭率较金黄色葡萄球菌的杀灭率好,考虑可能不同菌群对医用臭氧的敏感度有所不同,或臭氧对不同菌群的杀灭机制有所不同,至于具体的杀灭机制需进一步研究。