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本研究采集发病南方鲇进行了迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的分离鉴定,并对迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的双重PCR诊断方法进行构建。从乐山南方鲇养殖场采集自然发病南方鲇,无菌操作从病鱼肝、肾分离优势菌,结果从自然发病鱼肝、肾中分离到两株优势菌(CH0406和H0701)。人工感染试验确定其病原性,人工感染试验结果证实两分离株为南方鲇的致病菌,人工感染鱼出现与自然感染相似的临床症状与病变；对分离菌株进行各项理化性质测定发现,分离株CH0406在LB平板上28℃培养24h就能长出形成边缘整齐,灰白色,直径为0.5-1mm的圆形菌落,H0701在BHI培养基上28℃培养48h形成直径0.2-0.3mm针尖大小,表面光滑,边缘整齐,无色透明的圆形菌落的菌落；分离株CH0406和H0701生化特性分别与E. tarda标准菌株(ATCC15947)和E.ictaluri标准菌株(ATCC33202)一致；采用细菌16S rDNA保守区通用引物(F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, R:5’-TACGGCTACCT TGTTACGAC-3’)进行基因扩增,扩增出预期大小的约1500bp的目的片段,序列测定及系统发育分析表明,2分离株分别与GenBank中E.tarda和E.ictaluri 16S rDNA序列同源性均达99%以上；在基于16SrDNA序列构建的系统发育树上,CH0406与E.tarda聚为一族,而H0701与E.ictaluri聚为一族；根据E.tarda的gadB基因和E.ictaluri的eip基因序列设计两对特异性引物(gadB:F:5’-ATTTGGATTCCCGCTTTGGTTC A-3’,R:5’-GCACGACGCCGATGGTGTTCTC-3’;eip:F:5’-TCATCACATCATCTAG CGATT-3’,R:5’-CTTTACACAGATAGGCGATAC-3’),进一步鉴定分离病原菌,预计扩增出的特异性核酸片段大小分别为582bp和276bp,结果发现同时分别基于迟缓爱德华氏菌gadB基因和鮰爱德华氏菌eip基因进行的特异性PCR检测中,两分离菌均为阳性,根据以上结果将CH0406鉴定为E. tarda,将H0701鉴定为E.ictaluri。利用两对特异性引物对样品中迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌进行双重PCR扩增,优化反应条件,并对双重PCR方法的特异性和敏感性进行分析。优化后双重PCR反应体系为：25uL体系：10×PCR Buffer 2.5μL,10 mmol/L dNTPs 1.OμL, Taq DNA polymerase 0.5μL, Mg2+浓度的范围是1mmol/L至2.5mmol/L, E.tarda和E.ictaluri的上下游引物都各加0.7μmol/L,两种模板DNA质量浓度都为2.0ng/μL,加双蒸水至25μL；PCR反应条件为：94℃预变5min,94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸5min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳可检测到大小分别为582bp、276bp核酸条带,分别对应迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌。特异性试验发现,该双重PCR方法仅与相对应模板发生特异性扩增,而嗜水气单胞菌,无乳链球菌,海豚链球菌等对照菌株未能扩增出任何条带。该双重PCR方法对E. tarda与E.ictaluri的最低检限度为1×102cfu/mL。本研究所建立的检测E. tarda与E.ictaluri的双重PCR法快速,敏感性高,特异性强,可用于临床样品的检测。