研究背景:神经前体细胞(neural precursor cells,NPCs)是中枢神经系统中处于不同发育阶段的不成熟神经细胞的总称,具有自我更新、增殖和分化为各类神经细胞的潜能,是公认的神经损伤修复的种子细胞。应用体外扩增的NPCs对神经系统创伤、变性及退行性疾病的治疗具有广阔的应用前景。1992年,Reynolds首先建立了NPCs的体外悬浮培养方法,开创了NPCs体外培养、扩增及其应用的新纪元。1995年Gage建立了NPCs的贴壁培养方法,大大推动了对NPCs的相关研究。但目前国际上对NPCs的研究仍然处于初级阶段,对两种不同培养方法获得的NPCs生物学特性研究资料还非常缺乏。我国开展NPCs的研究起步较晚,目前主要使用悬浮培养的方法开展工作。为了深入开展对NPCs相关研究,本课题在完善NPCs贴壁培养方法的基础上,对比研究了两种培养条件下的NPCs的生物学特性,为深入开展NPCs的基础研究和临床应用研究提供实验依据。胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome,FAS)是母亲在妊娠期间过量饮酒造成的子代出生缺陷,其症状包括一系列的中枢神经系统发育异常。体内、外实验发现,酒精可抑制NPCs的增殖,并导致部分NPCs死亡,这被认为是FAS发病的原因之一。但对于酒精损伤NPCs的机理,目前了解还比较少。文献报道,连接蛋白43(connexin 43,Cx43)在NPCs增殖过程中具有重要的作用。酒精对NPCs增殖的抑制作用是否与Cx43的表达有关,目前尚未见相关报道。研究目的:1、对比研究贴壁培养法和悬浮培养法在体外培养获得的NPCs的生物学特性,为深入开展NPCs的基础研究和临床应用研究提供实验依据。2、建立体外贴壁培养NPCs的酒精损伤模型,研究酒精对体外培养的NPCs中Cx43表达的影响,探讨酒精抑制NPCs增殖的作用机理。研究方法:以孕14d的胎鼠端脑为实验材料,分别采用贴壁培养和悬浮培养方法进行NPCs的原代、传代及冻存复苏后培养,进行下列实验:1、两种培养方法获得的NPCs的生物学特性对比实验(1)倒置相差显微镜下,每天对培养细胞进行形态学观察,并拍照;(2)用免疫荧光细胞化学方法及流式细胞术鉴定培养细胞中NPCs的纯度;(3)用BrdU掺入方法分析NPCs的增殖能力;(4)用细胞计数方法分析两种原代培养方法获得的NPCs的生长曲线;(5)采用去除生长因子的方法诱导NPCs分化,用免疫荧光方法鉴定各类分化细胞并分析其比例特征。2、酒精对NPCs的Cx43的表达的影响(1)建立贴壁培养NPCs酒精损伤实验模型,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并拍照;(2)采用MTT法检测NPCs琥珀酸脱氢酶的变化,分析酒精对NPCs活性的影响;(3)采用免疫荧光方法观察体外贴壁培养的NPCs中Cx43的表达情况;(4)采用Western-blot法检测NPCs中Cx43的表达量,分析酒精对NPCs中Cx43表达的影响;(5)通过刻痕标记/荧光扩散实验,观察荧光黄(Lucifer Yellow,LY)在NPCs之间的扩散距离,分析酒精对NPCs间隙连接功能的影响。实验结果:1、两种培养方法获得的NPCs的生物学特性对比实验(1)形态学观察贴壁培养的NPCs表现出典型的神经上皮细胞的形态特征,细胞群体呈集落状生长,随着培养时间延长,细胞呈放射状向外延伸;悬浮培养的NPCs呈球状克隆生长,细胞多数呈圆形,细胞连接紧密。传代以及冻存复苏后培养的NPCs形态均无明显变化;(2) NPCs纯度鉴定原代贴壁培养细胞中nestin阳性细胞率由第3天的38.69%增加至第9天的93.76%,而原代悬浮培养细胞第9天的nestin阳性细胞率仅为59.75%;两者传代后第2天,贴壁培养细胞的nestin阳性细胞率可达98.36%,悬浮培养细胞为83.34%;冻存复苏后培养第4天,两种方法获得的NPCs纯度达均可达到99.9%;(3) NPCs的增殖能力检测原代贴壁培养的NPCs的增殖指数,由培养第3天的13.68%增加至最高的第7天的38.7%;悬浮培养第7天的NPCs的增殖指数亦达最高,但仅为33.47%;贴壁培养细胞在传代后第2天和复苏后培养第4天,增殖指数分别可达39.08%和39.25%,而悬浮培养的NPCs这两种条件下的增殖指数仅为36.95%和36.73%;(4)原代培养NPCs生长曲线分析两种培养方法获得的生长曲线均为“S”形曲线,但在细胞数量上有明显差异。贴壁培养第12天时,细胞数量最多,为初始接种数的68倍,继续培养细胞数量开始降低;悬浮培养第11天时,细胞数量即达最多,但仅为初始接种量的8.4倍;(5) NPCs的分化能力分析贴壁培养的NPCs诱导分化后培养7d,神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例分别为14.13%,29.99%和7.21%;而悬浮培养的NPCs诱导分化7d后,上述三者的比例分别为17.72%,24.81%和8.15%。2、酒精对NPCs的Cx43的表达的影响(1)形态学观察贴壁培养的NPCs经不同浓度酒精(25、50和100mmol/L)损伤24h后,细胞会表现为不同程度的胞体变圆和突起回缩,高浓度酒精(100mmol/L)可使培养物中出现明显的细胞碎片;(2) MTT法检测细胞活性三种酒精浓度下的细胞存活率分别为79.25%、70.60%和67.93%;(3)免疫荧光化学法检测NPCs中Cx43表达特点Cx43广泛分布于NPCs的细胞表面,并且在相邻NPCs胞体接触位置分布较为集中;(4) Western-blot检测NPCs中Cx43表达量的变化三种浓度的酒精作用NPCs24h后,Cx43/Actin值分别为:0.82、0.67、0.46和0.19;(5)刻痕标记/荧光扩散实验检测NPCs间隙连接功能的变化LY的传播距离及荧光信号强度随酒精损伤浓度的增加而变短或减弱。实验结论:1、贴壁培养法获得的NPCs便于进行细胞计数和形态学观察。2、原代和传代贴壁培养的细胞nestin阳性细胞率均高于悬浮培养细胞。3、原代和传代贴壁培养获得的NPCs均具有较强的自我扩增能力,而悬浮培养获得的NPCs自我扩增能力相对较差;两种NPCs冻存复苏后均能保持较高的自我扩增能力。4、贴壁培养获得的NPCs连续传代5代后扩增能力显著下降,而悬浮培养获得的NPCs在连续传代10次以上仍能较好地保持扩增能力。5、贴壁和悬浮培养获得的NPCs,分化能力无显著差别。6、贴壁培养的NPCs可以表达Cx43,酒精可以通过抑制NPCs中Cx43的表达来影响NPCs的间隙连接功能。