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目的:运用统计学的方法,对高产类胡萝卜色素菌株的发酵培养条件进行基本优化,得到最佳优化条件,为大规模工业化生产提供理论基础。对菌株所积累合成的色素进行初步定性分析和结构鉴定,同时对色素的稳定性进行相关分析。
方法:通过对影响红酵母色素产量的八个单因素试验,进行逐步单因素试验。然后用Plackett-Burman设计从八个因素中快速有效筛选出影响色素产量的显著因素,剔除非关键因素。然后设计最陡爬坡实验(steepest ascent design)使显著因素逼近最佳响应区域。最后通过Box-Behnken实验设计,利用SAS软件进行回归以及岭嵴分析得到各因素的最佳浓度。运用薄层层析法和高效液相法同时对色素的组成和结构进行定性分析和初步鉴定,对未知结构进行分析和推测。
结果:
1.通过逐步单因素实验,得到单因素最佳优化组合:蔗糖50g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物3 g/L,MgSO4·7H2O0.6 g/L,Na2HPO4 1 g/L,接种量10%,装载量为30/250ml,初始pH值为6.5。比优化前基础培养基(YPS)中的色素产量(3.8μg/ml)提高了75.6%(15.56μg/ml)。
2.通过Plackett-Burman试验,从8个相关因素中筛选出4个显著影响因子,其中蔗糖、蛋白胨、接种量的影响有显著正效应,应增加。酵母提取物的影响有显著负效应,应减少。
3.运用最陡爬坡实验,确定出响应面实验中心点:蔗糖60.25g/L、蛋白胨11.33 g/L、酵母膏2.675g/L、接种量11.65%。经二次回归拟合后求得回归方程为:Y1=15.593+0.482 X1-0.455X3-0.623 X1 X1-0.977 X1 X2+0.602X1 X3+0.697 X1X6-0.519 X2 X2-0.980 X2 X3由于回归方程曲面为鞍马面,需要进一步岭嵴分析找出最佳工艺条件。最终通过岭嵴分析后得到四种显著因素的最佳条件为:蔗糖62.0g/L,蛋白胨11.0g/L,酵母膏3.0g/L,接种量12%,色素产量的模型预测值为16.56μg/ml,经过验证实验得到的验证值为16.09μg/ml。充分说明利用响应面法建立的数学模型能够较好的预测黏红酵母的最大色素产量,有利于对黏红酵母发酵过程的控制。
4.通过对黏红酵母色素组分进行初步鉴定,其中除了主要含有β-胡萝卜素外,还含有三种其他成分。通过对红酵母色素稳定性的研究发现,该色素在60℃以下比较稳定,同样该色素对光照和氧气也比较敏感,所以我们在以后的实验研究中对于红酵母色素应避光,密封保存。从而降低人为因素对色素结构的破坏。
结论:确定了红酵母菌株的最佳发酵培养条件:蔗糖浓度62.0g/L,蛋白胨浓度 11.0g/L,酵母膏浓度3.0g/L,MgSO4·7H2O0.6 g/L,Na2HPO4 1.0 g/L,接种量12%,pH值6.5,装液量30mL/250 mL,28℃,180rpm/min的旋转摇床上培养120h后色素产量达16.09μg/ml。提取的目标产物除含有β-胡萝卜素外,还有三种其他成分,初步推测为红酵母红素、圆酵母素,和β-胡萝卜素的顺反异构体。对红酵母色素的稳定性进行研究,得到的结论是该色素对光照和温度最为敏感,其次是空气中的氧气,最佳保存方式:避光,密封,低温。