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目前,恶性肿瘤的高发病率和死亡率已经使其成为对人类生命构成严重威胁的疾病之一,而恶性肿瘤的侵袭转移引起的重要器官功能丧失是肿瘤致死的主要原因。由于恶性肿瘤的转移涉及多个环节,受到许多因素的共同影响,因此对转移相关因素作更广泛更深入的研究,具有十分重要的意义。在众多的转移相关因素中,具有不同功能的蛋白酶以及它们的抑制因子是近来受研究工作者重视的一大类因素,如:matriptase、肝细胞生长因子激活因子（hepatocyte growth factor activator,HGFA）、肝细胞生长因子激活因子抑制因子-1（hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1,HAI-1）。研究表明这些蛋白酶不仅参与细胞外基质的降解,还参与促进细胞生长的各种生长因子的活性调控,与各种肿瘤的转移密切相关。HAI-1作为HGFA的一种抑制因子能够与HGFA、matriptase等丝氨酸蛋白酶结合,调控这些蛋白酶的活性,从而可能调控肿瘤细胞的侵袭生长行为,因此为越来越多的研究者所关注。人HAI-1基因定位于染色体15q15,共有11个外显子组成,跨度为12kbp,其mRNA长2.4kb,编码一个由513个氨基酸残基组成的蛋白质。大量的研究表明HAI-1广泛分布于胃肠道、肺、支气管、乳腺等器官的上皮组织,而在胃癌、肠癌、乳癌等组织中的表达与相应正常组织相比有显著的下降。但另外的一些发现却与上述HAI-1在肿瘤细胞中的表达不是很一致,如HAI-1在35%的原发性肝癌病人中有表达,且在分化差的比分化好的肝癌组织中表达高,而在肝癌周围的正常组织中却无表达。另外,在肠道肿瘤侵袭前沿HAI-1有较强的阳性信号,mRNA水平也表现上升的趋势。最近的研究表明前列腺癌患者血清HAI-1水平明显高于良性前列腺增生或正常人,有远处转移或激素抵抗的患者血清HAI-1水平比局限性患者高。目前,HAI-1在不同肿瘤细胞或组织中表达水平不同的原因及相关机制还未阐明,可能与肿瘤细胞的发生及转移有一定的关系。在前期的研究工作中,我们重点研究了HAI-1在多种正常及肿瘤组织中的表达及对肿瘤细胞的作用,并根据不同情况下HAI-1表达变化的趋势推测HAI-1的表达可能部分受到丝氨酸蛋白酶的调控,因为在胃肠道、乳腺及肿瘤侵袭前沿等HAI-1表达升高的组织中均存在较高浓度的多种丝氨酸蛋白酶。蛋白酶对基因表达的调控主要通过位于细胞膜表面的蛋白酶激活受体（protease activated receptors,PARs）进行的,PARs是一类具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptor）。目前已发现有四个成员:PAR-1、PAR-2、PAR-3及PAR-4。PARs的N端经特异性蛋白酶水解而被活化,并通过激活与其偶联的G蛋白后,触发一系列信号传导,进而调控相应基因表达。相关的研究表明,一些蛋白酶可通过激活其相应的PAR促进肿瘤的发生和发展。因此,我们认为HAI-1在肿瘤侵袭前沿和部分肿瘤细胞中的表达上调,有可能与局部高浓度蛋白酶导致的PARs激活有关,受其调控。在这种情况下,高表达的HAI-1又可能通过其可逆性结合HGFA、matriptase等丝氨酸蛋白酶的能力,从而促进肿瘤的发生和发展。因此,在本课题中克隆了四种PAR全长编码区cDNA,构建了相应的真核表达载体,并通过转染和多种丝氨酸蛋白酶的处理初步研究了PARs对HM-1的表达及对细胞生长运动能力的影响,具体内容如下:1.四种PAR全长编码区cDNA的克隆及表达载体的构建为了获得四种PAR cDNA,首先分别从人肠癌SW620、HT-29细胞及人促结缔组织增生性小圆细胞瘤组织中提取总RNA,以总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到四种PAR的cDNA片段,大小分别为1277bp、1193bp、1124bp、1157bp,其中PAR-1、PAR-2、PAR-4克隆于pGEM-T Easy载体,PAR-3克隆于pMD-19 T载体,经DNA测序并与GenBank数据库序列进行比对,所克隆的四种PAR全长编码区的cDNA全部正确。用限制性内切酶EcoRI将PAR-1、PAR-2、PAR-4的cDNA从pGEM-T Easy载体切下,亚克隆于真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）的EcoRI位点,并分别经PstⅠ单酶切鉴定插入片段的方向,将正向插入片段的表达载体分别定为pcDNA3.1（+）/PAR-1、pcDNA3.1（+）/PAR-2及pcDNA3.1（+）/PAR-4,而PAR-3则用限制性内切酶BamHI和HindⅢ将其cDNA从pMD-19 T载体上切下,亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1（-）的BamHI和HindⅢ位点,经KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,将正向插入片段的表达载体定为pcDNA3.1（-）/PAR-3。2.PAR-2和PAR-4的转染及四种丝氨酸蛋白酶对HAI-1的表达影响利用LipofectamineTM2000将PAR-2及PAR-4的表达载体分别瞬时和稳定转染HT-29肠癌细胞,通过Westem Blot检测PAR-2、PAR-4及HAI-1在HT-29细胞中的表达,并建立稳定高表达PAR-2及PAR-4的HT-29细胞系。本课题选择了四种较为典型的丝氨酸蛋白酶:弹性蛋白酶、胰酶、凝血酶和糜蛋白酶,分别处理稳定转染PAR-2及PAR-4的HT-29细胞,通过WesternBlot检测0、0.5、1、2、4及8小时时间细胞中HAI-1的表达。结果显示瞬时转染了PAR-2及PAR-4的细胞中,PAR-2及PAR-4表达明显高于对照组,同时检测到HAI-1的表达水平也高于对照组。用四种丝氨酸蛋白酶处理后的细胞在不同时间HAI-1的表达呈现一定的变化趋势,转染细胞基本在2-4小时HAI-1表达达到较高水平,而对照组除了弹性蛋白酶处理组在0.5h达到最高峰外,其他三种酶处理组HAI-1表达基本在4-8小时达到最高。通过以上结果分析表明PAR-2及PAR-4的过表达能够促进HAI-1的表达,四种丝氨酸蛋白酶能够影响HAI-1的表达。3.PAR-2及PAR-4的过表达对HT-29细胞生长运动能力的影响用MTT法检测PAR-2及PAR-4过表达对HT-29细胞在体外生长能力的影响:将稳定转染PAR-2及PAR-4的HT-29细胞接种于96孔板,分别培养0～5天,加MTT,用DMSO溶解结晶,在570nm处读取吸光度值,绘制生长曲线。结果显示转染PAR-2及PAR-4的细胞生长与对照组相比,有减慢的趋势。采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析发现HT-29（pcDNA3.1（+）/PAR-2）的两株单克隆细胞与HT-29（pcDNA3.1（+））的生长趋势均有显著差异（克隆1P＜0.05,克隆2 P＜0.001）,与HT-29的生长趋势也有显著差异（P＜0.05）。表明PAR-2的过表达对HT-29细胞的生长具有一定的抑制作用。同时还发现HT-29（pcDNA3.1（+）/PAR-4）的两株单克隆细胞与HT-29（pcDNA3.1（+））的生长趋势具有显著差异（P＜0.001）,与HT-29的生长趋势也具有显著差异（P＜0.05）,表明PAR-4的过表达对HT-29细胞的生长也具有一定的抑制作用。利用划痕实验检测PAR-2及PAR-4过表达对HT-29细胞体外迁移能力的影响:将指数生长期的细胞接种于六孔板,同时加丝裂霉素C,培养24小时后,换含10%小牛血清的RPMI1640,用10μl加样枪头在六孔板中刮出划痕,分别再培养0、2、4、6天,在倒置显微镜下观察划痕边缘细胞向空白区扩散运动情况并记录。结果显示在0～2天内并无明显差异,第4天转染PAR-2及PAR-4的细胞向划痕区扩散,与对照组相比出现差异,并且这种差异随着时间的延长愈加明显,表明PAR-2及PAR-4的过表达能够促进细胞的扩散运动。通过以上实验,得出以下结论:1.PAR-2及PAR-4的过表达能够促进HAI-1的表达。2.四种丝氨酸蛋白酶能够影响HAI-1的表达。3.PAR-2及PAR-4的过表达能够抑制HT-29细胞的生长,促进细胞的运动。