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研究背景及目的:随着中国步入老龄化社会,骨关节炎的患者愈发增多,而对于中国这一批60岁以上的患者,由于年轻时大多从事了非常沉重的体力劳动,所以他们骨关节炎的病变程度非常严重,骨软骨缺损的面积会比较大,甚至继发软骨下骨内囊性空洞(也称为囊肿)及关节面塌陷。对于这部分病人来说,口服盐酸氨基葡萄糖或关节腔注射玻璃酸钠等保守治疗通常是无效的,而关节置换又费用不菲,所以,探求一种新型的治疗大面积骨软骨缺损、防止出现囊性空洞及关节面塌陷的方法势在必行。骨软骨缺损的治疗难点主要存在于软骨的修复,虽然广大学者们尝试了骨髓刺激、软骨移植、软骨细胞移植等多种方法,但软骨层的远期修复疗效依然不能令人满意。以往研究者们还从事了大量雌激素替代疗法防治绝经后妇女骨关节炎的研究,虽然可以改善关节疼痛的症状,但尚无确切证据证明雌激素可以促进软骨的再生。随着软骨组织工程技术的兴起,在各式各样的生物可降解性支架中加入骨髓间充质干细胞及促进骨髓间充质干细胞成软骨分化的生长因子同时,应用雌激素能否促进组织工程技术修复骨软骨缺损,对于其可行性尚缺乏足够的基础实验证据。软骨下骨内囊性空洞即可先于骨软骨缺损出现也可以出现在骨软骨缺损后,针对已发生骨软骨缺损的治疗,在修复过程中如何防止囊性空洞的形成,首先要弄清楚其形成的原因。迄今为止,众多学者从事了大量相关方面的研究,关于囊肿的形成机制主要有两种学说相持不下:(1)高压状态下关节滑液的侵入,(2)局部骨质代谢异常导致的骨吸收增强。破骨细胞作为骨吸收代谢的核心,目前关于破骨细胞与骨软骨缺损后修复过程中囊性空洞形成关系的研究报道较少;雌激素作为破骨细胞的调控因子,其对囊性空洞的发生是否有影响也鲜有报道。综上,本实验以囊性空洞的形成原因为切入点,研究破骨细胞在骨软骨缺损后自发修复过程中及软骨下骨内囊性空洞形成中所起的作用,同时通过大鼠去势及注射雌激素调节破骨细胞的活性,探讨雌激素对骨软骨缺损自发修复的影响,为雌激素在软骨组织工程学中的应用提供依据。研究方法:一、去势大鼠骨软骨缺损模型的建立4.动物分组:本实验选用SD(sprague dawley)大鼠作为模型,因为其对性激素敏感性高,且体型大于小鼠,方便做卵巢切除及输卵管结扎等操作,是目前国际上做去势研究常用的动物模型。健康雌性4月龄SD大鼠72只,体重210~250g,随机分为阴性对照组(A组)、去卵巢组(B组)和去卵巢+雌激素的治疗组(C组)。5.制备模型:取质量分数为3%的戊巴比妥钠酒精溶液,每只大鼠按0.1ml/100g腹腔注射麻醉后,取双侧腰背部纵行入路,B、C组分离并切除双侧卵巢,A组在卵巢周围切除相同质量的脂肪,术后C组大鼠每周按0.4ml/100g经腹腔注射0.025mg/ml的苯甲酸雌二醇一次;4周后,相同方法麻醉大鼠后,经膝关节髌韧带内侧入路,在股骨滑车上钻出全层骨软骨缺损(直径约2mm、深约1.5mm)。二、雌激素对骨软骨缺损修复的影响1.标本取材:分别在造模后第2、10、20周,每组各有8只大鼠被随机选出,过量注射戊巴比妥钠酒精溶液致死,取下股骨髁,随机挑选一半标本放入-80℃冰箱中保存待用,另一半放入中性甲醛溶液中固定。2.Micro-CT扫描观察及分析:固定好的标本置于Micro-CT机中,以骨软骨缺损处为中心行股骨髁矢状面扫描并观察,并在缺损区软骨下骨内选择感兴趣区进行重建,并行软骨下骨骨质微结构分析。3.标本脱钙切片行HE染色及番红O-固绿染色并观察形态学变化:股骨髁脱钙后石蜡包埋切片,切片厚度5μm,分别行HE染色及番红O-固绿染色后置于光学显微镜下观察缺损区形态学变化。三、破骨细胞数量活性变化及所起的作用1.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色:切片经TRAP染色后观察破骨细胞分布情况并计数缺损区软骨下骨内破骨细胞的数量。2.MMP-9免疫组化染色:微波抗原修复后,使用超敏二步法行免疫组化染色,观察MMP-9阳性细胞的分布情况。3.Real-time PCR检测目的基因表达情况:通过对比各组检测MMP-9、RANKL、OPG表达的相对值,明确破骨细胞活性的高低及变化情况。实验结果:一、雌激素可促进骨软骨缺损的修复3.在缺损修复的早期即第2周时,A、C两组软骨内成骨更快,生成的骨样基质更多。4.在缺损修复的中晚期即第10、20周时,各组均未见软骨层再生,但雌激素水平高的A、C两组骨质修复质量更高,不会像B组一样出现软骨下骨内骨囊肿、软骨下骨板裂缝及关节面塌陷。二、破骨细胞在骨软骨缺损修复中的作用1.在缺损修复的早期,破骨细胞主要参与骨质修复的重构。2.在缺损修复的中晚期,B组破骨细胞数量及活性过高,促使软骨下骨板出现裂缝,并同经裂缝侵入的关节滑液一起导致了软骨下骨内囊性空洞的形成,而A、C两组无类似病变。结论:在去卵巢大鼠软骨骨缺损自发修复模型中,去势造成破骨细胞活性增高,导致软骨下骨板裂缝形成、软骨下骨内囊性空洞出现;注射雌激素(苯甲酸雌二醇)可抑制破骨细胞活性并促进软骨内成骨,改善再生软骨下骨的质量,防止出现软骨下骨板裂缝及囊性空洞,为软骨修复提供良好的软骨下骨基础,在未来可应用于组织工程技术治疗骨软骨缺损。