无论是在发达国家还是发展中国家，糖尿病正以迅速发展的势头成为现代社会的流行病，严重危害公众健康。据WHO统计，2000年糖尿病的发病率为2.8％，约有1.71亿患者;到2030年预计将增长到4.4％，患病人数高达3.66亿。糖尿病及其并发症不仅影响了患者生活质量，也对社会医疗保健带来沉重经济负担。　　 目前2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)尚无根治方法，主要以对症治疗为主，长期药物治疗会使治疗效果降低。盐酸二甲双胍是2型糖尿病治疗的基础用药，二甲双胍的降糖作用主要是增加糖无氧酵解和抑制肝糖异生、降低肝糖输出，近年来大量研究证实，二甲双胍可通过增高糖尿病状态下骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白水平，促进骨骼肌中GLUT4的转位来增加周围组织对胰岛素的敏感性。　　 近年来研究发现，微量元素在胰岛素的生成、作用发挥以及糖尿病人的能量代谢中起着极为重要的作用，微量元素铬、硒、锌对骨骼肌细胞膜上的GLUT4的表达均有影响，锗元素在抗氧化应激等方面与铬、硒、锌很相似，已有文献报道，有机锗(Ge-132)对糖尿病小鼠具有明显的预防血糖升高的作用，然而，国内尚未见其在2型糖尿病治疗方面的相关实验研究，本实验通过观察有机锗(Ge-132)联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病治疗的影响，初步探讨其相关机制。　　 研究目的：　　 本实验通过观察联合应用盐酸二甲双胍和有机锗(Ge-132)对2型糖尿病大鼠治疗的影响，为2型糖尿病的预防和治疗提供新的思路和方向。　　 方法：　　 一、2型糖尿病大鼠模型的制备　　 本实验利用高糖高脂饮食诱导联合小剂量STZ腹腔注射的方法制备2型糖尿病动物模型，具体方法为:　　 （一）、动物分组及处理　　 大鼠适应性饲养1周后，逐一称重，随机分成2组，实验组40只，空白对照组10只。实验组饲糖尿病大鼠专用饲料;对照组饲喂实验大鼠普通饲料4周后，全部大鼠禁食不禁水12 h，测空腹血糖并称重，然后给实验组大鼠一性腹腔注射STZ30rag/(kg.Bw)，以空腹血糖值≥7.8mol/L为标准。　　 （二）、糖耐量实验　　 为验证所制备的糖尿病大鼠模型为2型糖尿病模型，进行口服葡萄糖耐量试验:建模成功后，随机选取实验组及空白对照组大鼠各10只，乙醚吸入式麻醉后，眶静脉丛取血，测其空腹血糖(0min)，留取1ml血液，3000r/min离心15min后分离血清待测空腹血清胰岛素(0min)后，按2g/kg予以50％葡萄糖溶液灌胃，于糖负荷后30、60、120、180 min测定即时血糖，并于每一时点取血1 ml，离心分离血清（方法同前），-20℃保存，待测血清胰岛素;计算胰岛素曲线下面积;稳态模型法评估胰岛素抵抗，胰岛素抵抗的标准:HOMA-IR与对照组比较差异有统计学意义。　　 二、有机锗联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响　　 （一）实验动物的分组　　 将建模成功的40只SD大鼠随机分为四组:模型对照组、二甲双胍组、有机锗(Ge-132)组、二甲双胍+有机锗(Ge-132)组。动物饲养在清洁级动物房，5只一笼，实验组与空白对照组同样饲喂实验大鼠普通饲料，自由饮食及去离子水;环境温度为25℃±1℃，相对湿度为40％-60％;饲养员昼夜循环为12h/12h(8:00am-8:00pm)。　　 （二）实验处理　　 1、实验组大鼠血糖稳定一周后，空白对照组和模型对照组:0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5ml/kg.d灌胃;二甲双胍组:盐酸二甲双胍CMC-Na混悬液200mg/kg.d灌胃;有机锗(Ge-132)组:Ge-132CMC-Na混悬液20mg/kg.d灌胃;二甲双胍+有机锗(Ge-132)组:盐酸二甲双胍CMC-Na混悬液200mg/kg.d+ Ge-132 CMC-Na混悬液20mg/kg.d灌胃。每周一、五测体重;周二、六测进食量、饮水量;周日测空腹血糖。各组试验干预均为8周。观察各组空腹血糖差异。　　 三、有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增效作用机制的初步探讨　　 （一）实验动物的分组　　 实验动物的分组同第二部分。　　 （二）实验处理　　 1、实验干预8周后，有机锗(Ge-132)对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响具体的检测方法及条件同第二部分。　　 2、免疫印迹法测量2型糖尿病大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白水平:　　 (1)组织匀浆　　 干预8周后，处死各组大鼠，取适量右侧大腿的比目鱼肌100mg，按1∶9稀释成1％的组织匀浆待测。　　 (2)蛋白含量的测定(BCA法蛋白浓度测定)　　 根据样品的数量，按BCA法蛋白浓度测定样品中目的蛋白的含量，测定A562吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。　　 (3) Western Blotting　　 抽提的蛋白经过蛋白定量后，进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为:80V*30min，待Marker完全分开后，转为120V。　　 蛋白转入PVDF膜，将PVDF膜与X射线片一同放入暗合盒内爆光，待显色后即可照相，照片经扫描后应用图像分析软件进行分析。　　 3、免疫组织化学染色(SP法)测量骨骼肌中GLUT4蛋白表达:　　 (1)组织切片制备　　 适量右侧大腿的比目鱼肌用4％多聚甲醛固定固定，20％蔗糖沉降过夜(4℃)，OCT包埋后用冰冻切片机恒冷箱切片，制成15μ m的骨骼肌切片。　　 (2)免疫组化染色　　 将切片SP显色，苏木素复染、封片。在多媒体彩色病理图像分析系统上，测定阳性染色面积百分比来衡量GLUT4蛋白在骨骼肌组织中的表达水平。　　 四、数据统计与处理　　 应用SPSS20.0统计软件对实验数据进行分析处理，血糖水平在各组间的比较利用重复测量资料的方差分析。两组间差异采用成组设计资料的t检验，组间两两比较采用LSD-t检验和SNK-q检验。实验数据以均数±标准差(x±s)表示，以P＜0.05作为有统计学意义。直接利用Gene tools对Western-blotting结果进行分析。分析结果采用单因素方差分析进行统计处理。　　 实验结果：　　 一、2型糖尿病大鼠模型的制备　　 （一）适应性喂养期间大鼠一般情况　　 大鼠精神状态良好，糖尿病鼠专用饲料喂养4周后，实验组与空白对照组相比体重(Body weight，BW)和FPG均增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 （二）2型糖尿病大鼠模型建立成功　　 建模成功后实验组大鼠身体进行性消瘦，反应迟钝，毛色枯黄，大便稀软。建模成功后实验组与空白对照组相比FPG升高（见图4）、胰岛素分泌高峰延迟，HOMA-IR及AUCi均明显高于空白对照组，具有统计学差异，说明实验组大鼠存在胰岛素抵抗，符合2型糖尿病的发病特点。　　 二、有机锗联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响　　 （一）2型糖尿病大鼠模型干预8周后，各组大鼠的FPG及GSP的变化　　 2型糖尿病大鼠模型干预8周后，测其各组大鼠的FPG，结果如下:与空白对照组相比，实验组大鼠血清中FPG、GSP均高于空白对照组;模型对照组与有机锗(Ge-132)组无明显差异(p＞0.05);二甲双胍组和二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG、GSP均低于模型对照组、有机锗(Ge-132)组，具有统计学差异;二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG、GSP低于二甲双胍组，有统计学差异(p＜0.05)，说明有机锗与二甲双胍联合治疗2型糖尿病大鼠的效果优于单用二甲双胍的治疗效果，但是单用有机锗不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。　　 （二）调整干预措施后，二甲双胍组和二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG的变化　　 在二甲双胍组的胃饲液中加入有机锗(Ge-132) cmc-Na混悬液20mg/kg，同时去除二甲双胍+有机锗(Ge-132)中的有机锗(Ge-132)后，分别于干预8周后的末次空腹血糖值做统计分析发现二甲双胍组加入有机锗(Ge-132)后与8周后的末次血糖无统计学差异，而与二甲双胍+有机锗(Ge-132)组有统计学差异，重复试验结果相同。　　 三、有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增敏作用机制的初步探讨　　 （一）各组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达免疫印迹法结果　　 利用单因素方差分析，对各组数据进行比较发现与空白对照组比较，模型对照组大鼠胞膜GLUT4表达明显下降;与模型对照组比较，二甲双胍+有机锗(Ge-132)组、二甲双胍组、有机锗(Ge-132)组均增加;二甲双胍+有机锗(Ge-132)组较二甲双胍组表达增加，差异有统计学意义。　　 （二）、各组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达免疫组化法结果　　 免疫组化染色结果以大鼠骨骼肌胞质中出现棕黄色物质为阳性，结果显示:空白对照组大鼠骨骼肌的阳性面积百分比最大;模型对照组骨骼肌细胞膜上阳性面积百分比明显减少;二甲双胍+有机锗(Ge-132)组阳性面积百分比接近空白对照组;而二甲双胍组或有机锗(Ge-132)组细胞膜上阳性面积百分比仅部分增加。免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致。　　 结论：　　 本实验通过高糖高脂饮食诱导联合小剂量腹腔注射STZ成功制备2型糖尿病动物模型，经过观察有机锗(Ge-132)对2型糖尿病大鼠治疗的影响以及骨骼肌中GLUT4蛋白表达免疫印迹法和免疫组化法的检测结果，初步探讨了有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增敏效果的机制。主要结论如下:　　 （一）有机锗联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响　　 1、2型糖尿病大鼠模型干预8周后，测其各组大鼠的FPG，结果有机锗(Ge-132)与二甲双胍联合治疗2型糖尿病大鼠的效果优于单用二甲双胍的治疗效果，但是单用有机锗不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。调整干预措施后，二甲双胍组和二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG的变化，也说明有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增效作用。　　 （二）各组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达结果　　 利用单因素方差分析，对各组数据进行比较发现与空白对照组比较，模型对照组大鼠胞膜GLUT4表达明显下降;与模型对照组比较，二甲双胍+有机锗（Ge-132）组和二甲双胍组的胞膜GLUT4表达增加;二甲双胍+有机锗(Ge-132)组较二甲双胍组增加。　　 免疫组化染色结果显示:空白对照组大鼠骨骼肌的细胞膜上GLUT4广泛分布;模型对照组骨骼肌细胞膜上GLUT4表达明显减少;二甲双胍+有机锗(Ge-132)组GLUT4的表达接近空白对照组;而二甲双胍组或有机锗(Ge-132)组细胞膜上GLUT4表达仅部分增加。免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致。　　 综上所述，通过对2型糖尿病大鼠的FPG、GSP以及骨骼肌中细胞膜上GLUT4的含量的表达比较，均说明有机锗(Ge-132)与二甲双胍联合治疗2型糖尿病大鼠的效果优于单用二甲双胍的治疗效果，有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增效作用。这种增效作用可能是有机锗(Ge-132)通过纠正糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜上GLUT4蛋白表达，增强骨骼肌对葡萄糖的摄取来实现的。