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本文主要从以下两个部分展开论述: 第一部分 去细胞肾脏支架的制备及检测 目的: 制备去细胞肾脏支架,检测其相关特性,为诱导损伤肾脏的再生奠定基础。 方法: 采用腹主动脉灌注法,依次灌注Triton X-100、SDS等去污剂,制备SD大鼠去细胞肾脏支架。H&E、PAS及Masson染色观察去细胞肾脏支架内细胞成分是否去除,以及ECM结构是否完整;SEM观察去细胞肾脏支架内微细结构的完整性,如Bowman氏囊、肾小球基底膜等是否保留;血管铸型观察支架内各级肾血管的结构;紫外-可见分光光度法检测肾脏支架内SDS的残留量;ELISA定量检测肾脏支架内IL-8、FGF、HGF、CTGF、TGF-β、VEGF以及PDGF等细胞因子的含量。 结果: SD大鼠肾脏去细胞支架外观呈半透明胶冻状,H&E、PAS、Masson染色未观察到细胞核成分,而细胞外基质结构未见断裂。SEM观察到支架内Bowman氏囊、肾小球基底膜及肾内动静脉等结构完整、形态完好。血管铸型观察到肾内各级动静脉结构完整,未受损。紫外-可见分光光度法检测到支架内SDS的含量约为50.0±1.7μg/g,低于毒性范围(133μg/g)。ELISA定量检测到支架内各种细胞因子的含量如下:IL-843.99 ng/L,FGF63.7 ng/L,HGF25.92 ng/L,CTGF68.235ng/L, TGF-β96.835ng/L, VEGF207.7ng/L, PDGF983.585 ng/L。 结论: 通过血管灌注法能够制备外观通透的去细胞肾脏支架,其内细胞成分完全去除,而细胞外基质结构保存完好,微细结构未受损,肾内各级血管结构完整。支架内各种细胞因子均有一定程度的保留。支架内的去污剂含量极低,位于正常安全值范畴内。 第二部分 去细胞肾脏支架诱导损伤肾脏再生的研究 目的: 探索去细胞肾脏支架能否诱导损伤肾脏的再生。 方法: 选取8周龄雄性SD大鼠(重约250g)行水合氯醛腹腔麻醉后,开腹行左侧肾脏下半部分切除术。实验组:应用去细胞肾脏支架对部分切除肾脏创面进行断面-断面吻合;对照组:直接缝合创伤肾脏的断面。术后1周、2周、4周、8周对两组动物进行肾脏B超探查观察左侧肾脏的大小及血流变化情况;行99mTc-DTPA肾动态显像测定实验动物的双侧肾小球滤过率。各时间点处死实验动物,对左侧肾脏进行大体观察,比较肾脏的大小;石蜡包埋连续切片行H&E染色,观察损伤肾脏的病理变化;石蜡切片免疫荧光双标nestin、AQP-1观察肾内干细胞、近曲肾小管上皮细胞的变化情况,并用Image Pro-Plus进行分析。 结果: 实验组动物的左侧肾脏可见手术缝线明显下移,肾脏实质明显增大,而对照组并未见到这一现象。B超可见移植支架区域有明显血流信号通过。肾动态显像示:术后6周,实验组左肾的GFR明显高于对照组GFR。病理切片H&E染色观察示:实验组肾脏手术切缘处的肾实质呈现损伤-损伤后修复性再生的病理变化,移植支架区域呈现炎症细胞浸润-支架肉芽化的变化。免疫荧光观察到,实验组肾脏再生区域nestin在术后1周主要表达于再生区域的肾小球及肾小管,2周时在肾小管的表达逐渐减少,8周时仅在肾小球表达。经Image Pro-Plus分析,知nestin在实验组的表达强于对照组。AQP-1的荧光结果示:术后1周、2周均无法检测到,4周时恢复表达。 结论: 去细胞肾脏支架能够诱导损伤肾脏的切缘肾实质再生,移植的去细胞支架逐渐变成肉芽组织。在支架的作用下,损伤肾脏的功能得到较高程度的恢复。肾脏再生区域的干细胞明显高于对照组,而切缘处肾小管上皮细胞呈现损伤-损伤后修复性再生。