背景及目的:逼尿肌过度活动(DO)是一种常见的膀胱功能障碍,可以引起尿急、尿频甚至急迫性尿失禁等临床表现,严重影响了患者的正常生活和身心健康,同时也日益成为社会公共医疗系统的沉重负担。正常膀胱在储尿期处于一种“安静”的状态,并且由于良好的顺应性,在一定容量范围内都保持很低的腔内压,这有利于尿液从上尿路的输送以及避免尿液的膀胱-输尿管反流。这个过程是下尿路器官在一系列复杂的神经、体液、心理意识以及自身等因素的调控下完成的协调过程。一旦由于某种原因,此种和谐遭到破坏,膀胱出现了不受意识控制的收缩,就会出现上述的临床表现,这些症候群被统称为膀胱过度活动症(overactive bladder,OAB),而这种自发性膀胱收缩则被称为逼尿肌过度活动(DO)并可以被临床尿动力学检查所记录和诊断。DO在西方国家发病率很高,被列为10种最常见的慢性疾病之一;国内虽然没有大规模的临床流行病学报告确切的发病率,然而就泌尿临床诊治情况来看,属于非常常见的疾病。DO目前尚无理想的治疗方法,最常用抗胆碱能药物进行治疗,但由于副作用过大,疗效有限,患者的治疗依从性非常差。因此,迫切需要寻找新的有效的替代疗法。关于DO的发病机制已经进行了大量的基础研究。综合来看,原因复杂,可能系多因素参与致病,不同病因导致的DO可能有不同的发病机理,但确切的发病机制还远未明了。目前,主要学说可归纳成神经源性和肌源性两种。按照ICS的分类,DO可分成特发性(idiopathic detrusor overactivity)和神经源性(neurogenic detrusor overactivity)两种。具有相关联的神经系统病变者称为神经源性,其余归为特发性,而后者最常继发于BOO性疾病,其中以BPH最为多见。尽管DO可能是多因素疾病,但目前已有大量证据表明,继发于梗阻后的膀胱逼尿肌本身结构和功能的改变在BOO所致DO的发生中占有极为重要的地位,即“肌源性”机理。针对不同病因所致DO可能具有不同发病机理这一特点,并且考虑到BOO所致DO为临床最为常见的类型,本课题拟针对BOO性DO的发生机理展开研究。在“肌源性”学说所提出的重要机理方面,认为“逼尿肌兴奋性升高与DO有着密切的关系”。但我们广泛查阅了相关文献后发现,这一重要的机理尚缺乏直接的证据支持。为此,以此做为课题的切入点。首先,第一部分应用目前研究细胞兴奋性最好的技术-穿孔膜片钳全细胞记录,在具有“真电流钳”功能的新型膜片钳放大器EPC-10上,选取评价兴奋性的可靠指标,对BOO性DO大鼠逼尿的兴奋性与正常逼尿肌进行检测与比较。然后,进一步研究这种高兴奋状态的具体分子机理(离子通道机制),选取在调控正常逼尿肌兴奋性中具有最重要作用的电压依赖性钙通道(VDCC)和大电导钙激活钾通道(BKca)作为主要研究对象,对逼尿肌兴奋的启动和抑制这两个层面进行考察。沿着这条主线,在第二部分中主要针对VDCC中的L型和T型的变化进行探索。综合应用膜片钳技术、激光共聚焦逼尿肌钙荧光探针浓度测量并结合相应的药理学工具,对BOO性DO逼尿肌VDCC中的L和T性钙通道的电学特性及其在细胞静息钙浓度调控进行检测并与正常逼尿肌进行比较,明确钙通道活动的改变及其与高兴奋性的关系;在第三部分,应用膜片钳技术,从单通道、全细胞电流密度以及瞬时外向钾电流(STOCs)三个方面对BKca通道的活性改变进行观察和比较,同时应用免疫印迹技术对BKca通道α、β亚单位的蛋白表达改变进行比较,明确BKca蛋白表达和功能活动的改变以及与高兴奋状态的关系。材料和方法1.采用近端尿道不全结扎法制作PBOO性雌性大鼠DO动物模型;2.模型制作后6-8周应用尿流动力仪充盈性膀胱测压筛选DO模型和对照。出现膀胱非排尿性收缩的尿道结扎大鼠作为DO组,无非排尿性收缩表现的正常同龄大鼠作为对照组;3.采用消化酶法急性分离适合膜片钳技术的单个逼尿肌细胞;4.用以两性霉素B为穿孔剂的穿孔膜片钳电流钳下记录逼尿肌细胞的静息电位、输入膜阻抗、阈刺激、动作电位阈电位等指标;5.用穿孔膜片钳全细胞电压钳下记录逼尿肌L和T型钙通道的峰值电流密度以及激活曲线、稳态失活曲线,及药理学特性;6.观察L和T型钙通道阻断剂对Fluo-4AM钙荧光探针标记的逼尿肌细胞静息钙浓度的影响;7.在穿孔膜片钳全细胞电压钳模式下记录BKca全细胞电流和STOCs电流,分析全细胞电流密度,STOCs平均电流幅度及平均发放频率。8.应用inside-out膜片记录逼尿肌BKca单通道电流,并对单通道特性进行电学和药理学鉴定,分析开放概率、平均开放时间、平均关闭时间、电导等参数;9.应用western blot技术对BKcaα、β亚单位蛋白表达情况进行比较。结果:(一)成功建立了大鼠BOO性DO动物模型,模型成功率高达82.3%。(二)成功建立了一种逼尿肌细胞急性酶分离方法,具有重复性好、操作简单的优点,并且适于膜片钳研究。(三)成功地将穿孔膜片钳技术技术应用在大鼠逼尿肌膜电位记录上,最大程度地反应了逼尿肌的电生理特性。(四)对DO和正常逼尿肌细胞兴奋性进行了各预设指标的检查,结果分析表明,BOO性DO逼尿肌细胞兴奋性较正常显著增加,这可能是DO发生的重要原因。(五)首次成功地进行了逼尿肌细胞的穿孔膜片钳电压依赖性钙通道电流的记录(六) DO逼尿肌L型钙通道发生变化,表现为:1.通道的密度显著增加,激活后可引起更多的钙内流,这可能是DO后逼尿肌收缩力增强的原因之一。2.通道失活曲线右移,处于失活状态的L型钙通道比例减少,提示:L型钙通道阻断剂需要使用更大的浓度才能将其完全抑制。(七) DO逼尿肌T型钙通道发生变化,表现为:1.通道的密度显著增加。2.通道失活曲线右移,激活曲线左移使得静息状态下T通道的“window current”(窗电流)增大,这是DO逼尿肌静息钙浓度增加的重要原因之一;3.通道激活曲线左移,这可能是DO兴奋性增加的重要原因。4.T型钙通道对于正常和DO逼尿肌中的静息钙浓度均有显著的调控作用,这是通过其窗电流实现的。使用T型钙通道阻断剂后,钙荧光的前后变化率DO逼尿肌大于正常逼尿肌,证明T型钙通道形成窗电流在DO逼尿肌是上调的。(八) DO逼尿肌BKca全细胞电流密度显著下降。(九) DO逼尿肌BKca单通道活动显著下降,具体为开放概率、平均开放时间下降而平均关闭时间以及单通道电导未发生改变。同时,单通道对钙敏感性下降。(十) DO逼尿肌瞬时外向钾电流(STOCs)的幅度以及频率显著下降.。(十一) DO逼尿肌BKca通道α、β亚单位蛋白表达显著下降.结论一、梗阻性DO逼尿肌细胞兴奋性显著高于正常逼尿肌,这可能是BOO后发生DO的重要原因。二、DO逼尿肌细胞L和T性钙通道密度增加,动力学发生诸多改变。这些改变易化了DO逼尿肌产生动作电位的能力,是其兴奋性升高的重要离子基础。三、DO逼尿肌中BKCa通道的蛋白表达和通道活动均出现显著的削弱,这使得其抑制细胞兴奋的能力严重减弱,这些变化也是DO逼尿肌兴奋性升高重要的离子基础。