研究背景 马尔尼菲青霉是一种双相性致病真菌，其感染常出现于免疫缺陷的病人，马尔尼菲青霉具有亲单核一巨噬系统的特性，机体主要通过巨噬细胞清除马尔尼菲青霉。马尔尼菲青霉在感染机体后，常隐匿发病，临床表现复杂。随着AIDS病人及器官移植术的增多，马尔尼菲青霉病的报道在国内也越来越多。由于马尔尼菲青霉的致病机制尚不完全清楚，导致了其在临床上诊断和治疗的困难。 固有免疫是机体抵抗异物及病原的第一道防线，参与启动、调节、协同适应性免疫并共同清除感染的真菌。固有免疫的效应细胞主要有吞噬细胞(中性粒细胞、单核一巨噬细胞)，NK细胞，NKT细胞，B1细胞等。模式识别受体是表达在固有免疫细胞胞膜及细胞器膜表面，识别其相应的病原相关分子模式，与真菌识别相关的受体主要有TLR-2、TLR-4、Dectin-1。它们分别识别不同真菌的胞壁成份，通过胞内细胞信号转导产生相应的炎性因子，进一步增强炎性反应并调节适应性免疫。研究证明了基因敲除TLR-2、TLR-4、Dectin-1后，吞噬细胞对真菌的反应性明显下降。受体的表达变化与其功能密切相关。 糖皮质激素作为临床常用的免疫抑制剂，可降低巨噬细胞的识别、吞噬真菌的能力并抑制促炎细胞因子的产生。以往的研究发现，其作用机制可能是通过抑制模式识别受体的信号转导过程，抑制炎性细胞因子的生成，但这并没有从根本上解释糖皮质激素对吞噬细胞免疫识别的抑制作用。 研究目的 通过马尔尼菲青霉刺激小鼠腹腔巨噬细胞，观察巨噬细胞与真菌识别的相关模式识别受体TLR-2、TLR-4、Dectin-1的表达变化，并以DEX作用于巨噬细胞后进一步研究其在巨噬细胞识别、吞噬真菌过程中可能的抑制作用。验证并评价马尔尼菲青霉对巨噬细胞固有免疫相关受体的作用及DEX的抑制机制。为马尔尼菲青霉发病机制的研究及今后可能的靶向治疗奠定基础。 材料与方法 1.实验分组： 1)马尔尼菲青霉对模式识别受体TLR-2、TLR-4、Dectin-1作用的研究分组：control组；LPS组； Laminarin组；PM组2)DEX对模式识别受体抑制作用的研究分组：control组；DEX组；PM组；PM+DEX组 2.实验菌株：分离自我科病人的马尔尼菲青霉临床株SUMS 0152。双相性诱导与菌株的培养：以温度作为处理因素，体外进行双相性诱导，37℃诱导酵母相的转变。收集酵母相菌株，以65℃水浴灭活1h。 3.实验动物及细胞：雄性BALB／C小鼠，以液体硫乙醇酸盐刺激后通过灌洗收集腹腔巨噬细胞。 4.方法： 1)巨噬细胞与PM反应后的激活采用EIJSA法分别检测共培养上清液中TNF-α，IL-12释放水平的改变；Real Time PCR法检测巨噬细胞TNF-α，IL-12基因水平的改变。 2)共培养后TLR-2、TLR-4、Dectin-1表达的改变采用流式细胞术及Real Time PCR法检测共培养后小鼠腹腔巨噬细胞TLR-2、TLR-4、Dectin-1蛋白及基因表达变化；共聚焦显微镜观察共培养后巨噬细胞TLR-2、TLR-4、Dectin-1的荧光显色变化。 3)DEX对巨噬细胞TLR-2、TLR-4、Dectin-1的影响首先用ELISA法分别检测不同浓度的DEX介入后共培养小鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α浓度的变化，从而确定DEX的抑制浓度；应用Westen bolt、Real Time PCR检测DEX介入后共培养小鼠腹腔巨噬细胞TLR-2、TLR-4、Dectin-1、MyD88蛋白及基因的表达变化。最后以共聚焦显微镜观察DEX介入后共培养小鼠腹腔巨噬细胞TLR-2、TLR-4、Dectin-1的荧光显色变化。 结果 1.小鼠腹腔巨噬细胞在识别、吞噬、清除马尔尼菲青霉的过程中，可产生炎性细胞因子TNF-α、IL-12。 2.马尔尼菲青霉作用巨噬细胞后，可明显的上调TLR-2、TLR-4、Dectin-1蛋白及基因的表达。 3.DEX抑制共培养后巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-12的产生。 4.DEX下调巨噬细胞及共培养后巨噬细胞TLR-4、Dectin-1、MyD88的表达，上调TLR-2表达。 结论 1.巨噬细胞识别与吞噬马尔尼菲青霉及产生相应炎性因子的通过模式识别受体TLR-2、 TLR-4、Dectin-1完成。 2.DEX通过下调TLR-4、Dectin-1、MyD88及抑制炎性因子的产生实现了其对巨噬细胞的固有免疫反应的抑制。 3.以上研究成果可为真菌感染的靶向治疗提供了新的思路和依据。 4.通过对PRRs的调节校正长期应用激素所致的免疫抑制状态是可行的。