甜高粱遗传转化体系的建立及再生相关遗传位点的初步确定

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高粱(Sorghum bicolorL.Moench)是一种重要的粮食、饲草及能源等多用途C4作物。甜高粱是籽实高粱的一个变种,优良的抗逆性、高生物量和高秸秆含糖量等特点使其成为粮食和工业原料应用最具前景的作物之一。生物技术是有效的作物改良技术,而高效的遗传转化体系是生物技术应用的先决条件之一。高粱是公认的离体组织培养及遗传转化较困难的作物,主要瓶颈是外植体再生困难、遗传转化效率低及基因型依赖性大。目前,高粱遗传转化仅在几个籽实高粱品种中获得成功,成功的甜高粱遗传转化报道很少。  本研究以Mn-3025和Keller等20个甜高粱品种以及JR105等5个籽实高粱品种为试验材料,分别对脱分化和再分化过程中主要影响因素进行了系统的研究,并深入分析了不同基因型愈伤组织再分化的依赖性,建立了一套适宜籽实高粱和甜高粱基因型的遗传转化再生体系;进行了SbGABA-T1和SbGABA-T2基因过表达分析,并结合CRISPR/Cas9系统对2个高粱基因SbN4和SbG2进行基因敲除试验,验证了该技术的有效性。同时,通过全基因组关联分析初步定位了4个与高粱再生相关的候选遗传位点。  本研究获得如下结果:  1、建立了适宜甜高粱和籽实高粱的植物再生和遗传转化体系。诱导愈伤培养基中添加1μM Cu2+和2 mg/L2,4-D,分化培养基添加1 mg/L IAA和1mg/L6-BA,是本研究中优化的最佳培养基组成。据此优化体系对25个高粱品种进行再生实验,其中有23个成功地分化成苗。甜高粱品种Keller和Mn-3025及籽实高粱品种JR105和871300诱导愈伤组织及分化出苗情况最好,效率达80%。以优化的再生体系为基础,建立了农杆菌介导的高粱遗传转化体系。  2、检测了不同基因型遗传转化效率,并成功获得目的基因转基因植株。甜高粱品种中,Keller遗传转化效率为3~7%,Mn-3025为8~20%;籽实高粱品种JR105的转化效率为7~16%。利用该技术体系对SbGABA-T1和SbGABA-T2基因进行过表达分析,共获得17株转基因阳性苗。同时结合CRISPR/Cas9体系进行基因敲除验证,获得转pOs-cas9-SbN4阳性苗3株以及转pOs-cas9-SbG2载体阳性苗18株,为后续基因功能分析提供了材料。  3、全基因组关联分析初步确定调控高粱再生相关性状的候选遗传位点。发现不同品种间再生出苗率差异较大,在0~90%之间,籽粒颜色影响幼胚脱分化形成愈伤组织,进而影响幼胚再生。通过重测序数据挖掘出2620个SNP标记,与74个高粱品种进行关联分析,初步确定了与再生相关的4个SNP位点,包括1个位于基因Sb02g028620内与再生出苗率相关的SNP位点;3个与籽粒颜色相关的SNPs位点,分别位于基因Sb01g001290,Sb04g009220和Sb08g001010内。
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