研究背景心肌缺血后有效地再灌注治疗是限制急性心肌缺血性坏死的最有效方法。然而心肌缺血再灌注的最终结果不但取决于缺血持续的时间,也依赖于发生再灌注损伤的程度。再灌注时伴随出现的氧自由基增多、细胞内钙超载、微血管损伤、多型核白细胞积聚以及炎症的激活,可导致心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI),引起细胞损伤的进一步加重；另外,心脏直视手术中,体外循环复灌中引起的心肌缺血性损伤和再灌注损伤是影响术后心脏功能恢复的重要因素,其损伤越来越引起人们的重视,寻求切实有效的方法来治疗缺血再灌注损伤一直是心血管外科领域的研究重点。近年来,中医药对MIRI的保护作用的实验研究得到重视,特别是传统中草药中的提取物,相关研究已经证实了其在MIRI中的有效性和实用性。本研究所选药材木豆叶为豆科木豆属落叶灌木木豆(Cajanus cajan (L.)Millsp)的干燥叶片及嫩枝。木豆叶中主要含有牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素等多种黄酮类成分,具有降血压、止痉挛、抗感染、抗菌、辐射保护以及清除自由基的作用。近年来,有关木豆叶提取物的相关报道较多,但是关于木豆叶提取物应用于治疗心血管疾病的药理学研究鲜有报道,开发适合预防或治疗心血管疾病的木豆叶提取物前景广阔。随着对木豆叶及其提取物临床疗效的进一步研究,木豆叶药材的质量控制问题也渐渐受到人们的关注。目前,木豆叶的质量控制多采用牡荆苷、异牡荆苷作为指标,但仅仅依靠单一或几个化学成分并不能全面体现木豆叶的药效,也不能从整体上评价木豆叶的质量,不利于木豆叶的临床应用和国际化。中药指纹图谱质量控制技术能够确保中药、中成药成分的一致性、疗效的安全性及可靠性,能全面反映中药材所含化学成分的种类与数量,从整体上控制药材质量,既符合传统中医药理论,又符合现代化药品质控的技术手段支持。囚此,中药指纹图谱目前已成为公认的反映中药材及中药制剂质量标准的理想方法。然而,目前对于木豆叶提取物尚没有系统的指纹图谱研究。鉴于木豆叶治疗心血管疾病的开发潜力,以及色谱指纹图谱对评价药材质量的有效性,本研究建立了木豆叶水提物的指纹图谱,并根据指纹图谱结果选用海南产木豆叶药材,通过建立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型,观察对比不同剂量木豆叶水提物对再灌注损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。研究目的(1)建立木豆叶提取物HPLC指纹图谱,为木豆叶药材的鉴别与质量控制提供参考；(2)通过在整体动物水平模拟心肌缺血再灌注损伤,观察木豆叶提取物对受损心肌的保护作用,并比较不同剂量的木豆叶提取物对大鼠缺血再灌注心肌的作用是否有差异；(3)通过对各项指标的检测,评估H202对H9c2细胞造成的损伤,确定木豆叶提取物及H202作用的最佳剂量,观察木豆叶提取物预处理对H202诱导的H9c2细胞氧化应激损伤后的保护作用；(4)通过应用PI3K抑制剂,观察木豆叶提取物对H202损伤后H9c2细胞p-Akt、eNOS以及p-eNOS蛋白表达的影响,探讨其可能的信号调控机制。研究方法(1)木豆叶提取物HPLC指纹图谱的建立。采用Diamonsil C18(2) (250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-1%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL-min-1,柱温40℃,检测波长268 nm。(2)木豆叶提取物对雄性SD大鼠急性心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究。采用健康SD雄性大鼠,结扎左冠状动脉前降支30min,再灌注90min建立心肌缺血再灌注损伤模型,记录缺血期间及再灌注期间心功能的变化；通过HE染色观察木豆叶提取物对缺血再灌注损伤心肌细胞形态学的影响；对各组心肌梗死面积进行统计；记录心率失常发生率及持续时间；检测大鼠血清中LDH、SOD、MDA、NO、GSH-PX、CK等生化指标的含量；(3)木豆叶提取物预处理对H202损伤后H9c2细胞保护作用及其作用机制的研究。采用MTT法,以过氧化氢(H202)作为外源性氧化应激刺激,观察木豆叶提取物对受损H9c2细胞活性的影响,以及木豆叶提取物对培养液上清LDH、SOD、MDA及NO含量的影响,并确定H202及木豆叶提取物作用的最佳剂量;采用Western-bloting方法分析木豆叶提取物对加入PI3K抑制剂预处理后的受损H9c2细胞内p-Akt、eNOS以及p-eNOS蛋白量的影响。研究结果采用高效液相色谱仪分析木豆叶水提物,分别建立了云南木豆叶和海南木豆叶水提物的指纹图谱,该方法精密度高、重现性和稳定性良好。对海南及云南两地木豆叶药材分别进行指纹图谱分析,结果显示,两地木豆叶药材共有指纹峰较多,确认其中1个峰的归属为牡荆苷。云南木豆叶水提物指纹图谱和海南木豆叶相比,色谱峰在数的方面基本相仿,即基本成分相似,但色谱峰在“量”的方面即色谱峰面积相差较大。整体动物实验表明,结扎大鼠左冠状动脉前降支所致心肌缺血再灌注损伤,模拟了许多心血管疾病共同的病理生理过程一氧自由基增多,木豆叶提取物可以改善大鼠心功能,减轻再灌注损伤造成的心肌细胞水肿、充血程度,缩小心肌损伤面积,降低血清中LDH、MDA、CK的含量,并提高SOD、NO、GSH-PX的含量。细胞实验表明,木豆叶提取物可以提高细胞存活力,降低细胞上清液中LDH的漏出量,升高SOD活性,降低MDA生成量,升高NO含量,抑制H9c2细胞因H202损伤后导致的细胞凋亡,上调p-Akt及p-eNOS蛋白量的表达。合用PI3K抑制剂LY294002可对抗木豆叶提取物的上述保护作用,结果提示PI3K可能是木豆叶提取物的保护作用通路上的信号靶点。研究结论本课题所建立的木豆叶指纹图谱具有较高的重现性、专属性和可行性,为木豆叶质量控制提供了新的手段,并且为木豆叶药理作用的进一步研究提供了物质基础。木豆叶水提物对结扎大鼠冠状动脉左前降支所致心肌缺血再灌注损伤和H2O2损伤的H9c2细胞均具有保护作用。初步表明木豆叶提取物可通过提高大鼠抗氧化酶活性,增强清除自由基能力,减轻缺血再灌注导致的自由基损伤。其作用机制推测为木豆叶提取物诱导心肌细胞产生适量NO作为触发因子激活其下游的PI3K,产生预适应样保护作用,上调蛋白p-Akt及p-eNOS的表达,从而产生心肌保护作用；上调的eNOS可进一步促进NO生成,延续木豆叶提取物在第二窗中的保护作用。