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背景:在肿瘤免疫疗法中,抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)是体内外扩增抗原特异性T细胞的有效工具,但仍面临耗时长、花费高、扩增困难以及生物安全等问题。随着非细胞型人工抗原提呈细胞的迅速发展,近年来开发出了纳米级人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cells,aAPC)。相比细胞大小的aAPC,它具有更好的生物分布并引起的栓塞更少,但仍有不足之处,比如,与细胞大小的aAPC相比,它更容易被巨噬细胞所摄取并且与T细胞的接触表面积也更小,所以扩增T细胞能力相对较弱;此外,aAPC扩增的T细胞克隆数相对单一,不够广泛。目的:对纳米级aAPC进行优化,提高其抗吞噬和扩增T细胞的能力,并与其他免疫疗法(纳米肿瘤疫苗)相结合,旨在诱导更完善的免疫反应。方法和结果:(1)制备及验证:首先以聚乳酸羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid,PLGA)为原料,采用双乳液法制备球形PLGA纳米颗粒,接着对其进行拉伸和PEG化,然后在表面修饰H-2Kb/TRP2180-188-Ig二聚体(信号1)和anti-CD28(信号2),从而获得相应的aAPCs。结果显示:我们制备了直径约200 nm的球形aAPCs(SaAPC),椭圆形 aAPCs(EaAPC),PEG化的椭圆形 aAPCs(EaAPCPEG)以及表面修饰了抗吞噬分子CD47-Fc的EaAPCPEG(EaAPCPEG/CD47)。(2)体内外抗吞噬能力评估:将PE标记的aAPCs与巨噬细胞共孵育6小时,然后用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评估巨噬细胞对aAPCs的吞噬,结果显示:与 EaAPCPEG、EaAPC、SaAPC 和 Blank-NPs 组相比,EaAPCPEG/CD47 组在体内外被细胞摄取的量最少;将aAPCs注入荷瘤小鼠体内,检测其与脾脏免疫细胞接触情况,发现EaAPCPEG/CD47与CD8+T细胞接触最多,与吞噬细胞接触最少。(3)抗肿瘤及扩增特异性T细胞能力评估:在C57BL/6鼠皮下接种黑色素瘤细胞B16后第7、9和11天经尾静脉三次注射aAPCs,对荷瘤小鼠进行主动免疫治疗,每三天观察肿瘤生长情况,第28天处死小鼠,评估aAPCs抗肿瘤能力,流式检测外周血、脾脏和肿瘤组织标本中TRP2180-188特异性CD8+T细胞、IFN-γ+/CD8+T细胞的比例,并取鼠脾淋巴细胞经CSFE预染后与B16细胞共培养检测其杀伤肿瘤细胞的能力。结果表明EaAPCPEG/CD47组抑制肿瘤生长和延长小鼠生存时间效果最显著,并且该组荷瘤小鼠特异性CD8+T细胞和IFN-γ+/CD8+T细胞频率最高,脾淋巴细胞杀伤靶细胞能力最强。(4)联合治疗抗肿瘤及机制探索:制备PLGA纳米球,在内部包裹肿瘤细胞裂解物的浓缩液(tumor cell lysate,TCL),并在表面修饰PEI,以促进吞噬细胞内吞和溶酶体逃逸效应,从而获得TPP(TCL-PLGA-PEI),然后验证TPP是否被APC所摄取,再与EaAPCPEG/CD47联合抗肿瘤治疗,评估联合治疗的抗肿瘤能力并探索相关机制。结果显示:我们成功制备了 TPP,且可以在体外被APC吞噬。联合治疗比单独治疗获得了更好的抗肿瘤效果;可以诱导更显著的效应性T细胞,提高CD4+T、CD8+T和TRP2180-188特异性CD8+T细胞的比例;增强了 CD8+T细胞的活化、脱颗粒能力及体外增殖活性;抑制调节性T细胞的效应更显著;促进炎症性细胞因子分泌同时降低抑制性细胞因子的产生;此外,联合治疗组小鼠肿瘤组织中CD4+T和CD8+T细胞的浸润能力更强。结论:颗粒拉伸、PEG化和CD47-Fc修饰的叠加或协同作用使纳米aAPC被吞噬细胞摄取的量减少,并诱导更强的抗原特异性T细胞反应,增强了抑制肿瘤生长的能力。此外,联合纳米肿瘤疫苗可以诱导更广泛的免疫反应并获得更佳的抗肿瘤效应。因此,本研究为肿瘤的特异性主动免疫治疗提供了一个优化方案。