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第一部分：SD大鼠BMSCs的分离培养、鉴定及冻存复苏目的：掌握SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增的方法，并探讨其生物学特性。方法：无菌条件下取出SD大鼠双侧股骨、胫骨，用含10％FBS的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集细胞，离心，去上清，重悬，计数后，置于含10％FBS的L-DMEM培养基中，37℃、5％CO2环境下进行培养，应用全骨髓培养法结合贴壁分离的方法进行纯化。待细胞达90％融合时，胰酶消化2-3min后进行传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。计数板计数法测定大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线，从而进一步了解其生长特性。通过流式细胞仪进行细胞鉴定。结果：原代培养显示24h后即可看到有少许细胞贴壁，刚贴壁的BMSCs仍保持圆形，48h贴壁细胞增多，开始呈现成纤维细胞样形态，伸突，呈短梭形、三角或多角形。最初2～5天细胞增殖较慢，呈克隆样生长，细胞向四周伸展。第6-9天时细胞集落迅速增多，呈旋涡状，并向周围不断扩大，原代培养12-15天，细胞80～90％融合，即可以传代。一般情况下传至第4、5代可获得形态均一、增长旺盛的BMSCs纯化细胞。P2、P4、P6细胞生长曲线基本相同，分为潜伏期(第1-2天)、对数生长期(第3-5天)和平台期(第6-7天)，且几代细胞间生长状况稳定。取生长状态良好的第5代BMSCs，应用流式细胞仪进行表面抗原标志物鉴定的结果显示：CD90(99.8％)、CD29（93.7%）阳性，CD34(0.8％)、CD45(1.3％)阴性。结论：1、全骨髓培养结合贴壁分离法能够在体外简单、快速的分离、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，并使其能在体外迅速得到增殖。2、采用全骨髓培养结合贴壁分离法分离培养的BMSCs性状稳定，操作简单实用，为BMSCs的进一步实验研究提供了良好的细胞模型。第二部分自体神经外膜小间隙吻合法构建的神经再生室内植入BMSCs修复周围神经断裂的实验研究目的：设计自体神经外膜小间隙吻合法构建大鼠坐骨神经再生室模型，并通过植入骨髓间充质干细胞改变神经再生室的微环境，观察其对损伤神经的再生和修复作用。方法：采用健康雄性清洁级SD大鼠32只，随机分成2组，对照组（L-DMEM组）16只，实验组（BMSCs组）16只。各组大鼠左下肢坐骨神经锐刀切断后，均行自体神经外膜小间隙吻合法修复。对照组神经再生室内注入50ul不含BMSCs的L-DMEM培养液，即L-DMEM组。实验组神经再生室内注入50ul含BMSCs的培养液。通过一般状态、光镜下大体形态、坐骨神经功能指数、运动神经传导速度、组织学和免疫组织化学、透射电镜超微结构观察比较两组大鼠神经再生和功能恢复情况。结果：术后4周免疫组织化学染色观察结果发现实验组术后4周可见较多BrdU阳性细胞，对照组无BrdU阳性细胞，表明BMSCs能够在局部神经再生室内存活并发挥修复作用。术后12周时，本实验形态学观察发现局部神经再生室内植入BMSCs的实验组相比于未植入BMSCs的对照组周围组织粘连较轻，神经纤维较规则，结缔组织增生不明显，雪旺氏细胞增生明显，数量较多，再生神经轴突和髓鞘较为成熟。功能学指标大鼠坐骨神经功能指数结果显示4周到12周SFI逐渐恢复。经统计学分析，术后4周、8周、12周，实验组SFI恢复优于对照组，差异具有统计学意义（p<0.05）。神经电生理检测显示实验组的坐骨神经运动神经传导速度高于对照组，差异具有统计学意义（p<0.05）。结论：1、自体神经外膜小间隙吻合法联合BMSCs移植能够促进周围神经再生和功能恢复。2、体外培养的BMSCs可进行体内移植，植入神经再生室后能在局部损伤微环境中发挥作用，促进周围神经损伤修复。