研究背景及目的急性白血病是一种最常见的血液系统恶性肿瘤,占国内肿瘤发病率的第六位,是35岁以下发病率、病死率最高的恶性肿瘤。小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高,每年至少以1.5万新病人的速度递增。虽然联合化疗和造血干细胞移植大大提高了患者的总体完全缓解率(CR)和五年无病生存率(DFS),但是,仍有相当一部分患者因为不能耐受化疗相关的毒副作用和复发而治疗失败。分子靶向治疗能够特异性杀伤肿瘤细胞,最大限度地减少非靶向组织细胞的毒副作用,因此,成为白血病治疗研究的热点。其中,单抗导向的靶向治疗是分子靶向治疗研究的重要领域。近年,CD20和CD33等单抗已在临床分别广泛应用于B系非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和AML的治疗,取得了一定的疗效。为了更有效地治疗白血病,需要研制和开发更多的能够识别白血病细胞的单克隆抗体(单抗,Mab)药物。白血病干细胞(leukemia stem cells, LSCs)是白血病复发的根源,如果有单抗能够较特异性地靶向白血病干细胞,白血病的治疗和预后将会有新的突破。3A4是本实验室自行研制的鼠抗人CD45RA单抗,前期研究发现,与现有的抗CD45RA抗体(克隆名：L48)相比,3A4能够识别更多的白血病幼稚细胞。并且,3A4能够识别髓系白血病细胞系KG1a中超过99%的白血病干细胞。因此,我们对3A4单抗的生物学性质和功能,3A4基因工程抗体等方面进行了深入和系统的研究,以期发现该新单抗在白血病靶向治疗中的潜在应用价值。研究包括两个部分：1.3A4鼠源性抗体的蛋白性质和功能研究；2.3A4基因工程抗体的制备和活性鉴定。方法1 3A4抗体的蛋白性质和功能研究1.1 3A4抗体的纯化和性质研究：通过有限稀释法对3A4杂交瘤细胞进行亚克隆,获得最高纯度的杂交瘤细胞系；通过流式细胞术(Flow cytometry, FCM)鉴定3A4抗体的免疫球蛋白亚类；通过阻滞实验确定3A4识别的抗原表位；通过SPA Sepharose亲和层析法纯化腹水获得纯化抗体,SDS-PAGE鉴定抗体的分子量。1.2 3A4抗原表达谱的研究：以改良Marshall(?)去制备直标异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC)抗体3A4-FITC, FCM比较其和美国Becton-Dickinson (BD)公司的CD45RA(克隆名：L48)识别的抗原(Ag)在白血病细胞系、初发白血病幼稚细胞、复发及耐药白血病幼稚细胞上的表达。同时,FCM检测3A4 Ab识别的抗原在CD34+CD38-CD123+白血病干细胞上的表达。1.3 3A4抗体功能研究：通过木瓜酶消化结合FCM检测抗体内化程度；通过补体依赖的细胞毒实验(CDC)了解3A4与抗原的特异性结合及激活补体的能力；通过改良的活泼酯法制备去甲斑蝥素(Norcantharidin)耦联3A4抗体免疫毒素(3A4-NCTD),检测其靶向杀伤功能。2 3A4基因工程抗体的制备和活性研究2.1 3A4重、轻链可变区基因克隆：根据鼠免疫球蛋白重、轻链可变区的恒定区和框架区设计引物,通过RT-PCR扩增3A4重、轻链可变区基因序列VH3A4和VL3A4,并将序列克隆至pGEM(?)-T easy载体。2.2 3A4单链抗体ScFv3A4真核表达载体的构建和表达：设计包括酶切位点和G4Slinker序列的引物,通过SOE-PCR将VH3A4和VL3A4序列相连,获得单链抗体基因序列ScFv3A4,将该序列插入真核表达载体pcDNA3.1,以此转染中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,使之表达单链抗体ScFv3A4。FCM检测抗体活性,竞争结合实验测定抗体相对亲和力,细胞免疫荧光法检测工程细胞胞浆内重组蛋白的表达,RT-PCR检测目的基因是否整合至宿主细胞DNA。2.3 3A4人鼠嵌合型抗体Hm3A4真核表达载体的构建和表达：设计包括酶切位点的引物,扩增ScFv3A4基因,将单链基因ScFv3A4插入自行改造的嵌合型抗体真核表达载体pHMCH3(具体改造方法正准备申请专利,在此不作详述),以此真核表达载体转染CHO细胞,使之表达人鼠嵌合型抗体Hm3A4。FCM检测抗体活性,滴定实验了解其培养上清中的抗体滴度,竞争结合实验测定抗体相对亲和力,细胞免疫荧光法检测工程细胞胞浆内重组蛋白的表达,RT-PCR检测目的基因是否整合至宿主细胞DNA。2.4嵌合抗体Hm3A4功能研究：以无血清培养Hm3A4CHO,通过SPA Sepharose亲和层析法纯化培养上清,Western-blot鉴定蛋白分子量。通过CDC作用检测Hm3A4是否能够激活补体杀伤靶细胞,通过抗体依赖介导细胞毒(ADCC)作用检测Hm3A4是否具有抗体依赖介导细胞毒性效应。结果1鼠源性抗体的蛋白性质和功能研究1.1 3A4Ab的纯化：亚克隆获得高纯度的细胞系G2。FCM检测免疫球蛋白亚型,3A4和羊抗鼠重链IgG1反应阳性率为99.48%,和羊抗鼠轻链K反应阳性率为99.02%。对CD45RA、CD45和CD45RO的阻滞实验显示,3A4阻滞前后,CD45RA阳性率分别为98.18%和8.15%；CD45阳性率分别为99.96%和99.77%,CD45RO阳性率分别为99.95%和99.96%。SPA Sepharose亲和层析法纯化腹水获得20mg纯化抗体SDS-PAGE鉴定重链分子量为57.9kDa,轻链分子量为30.0kDa。1.2 3A4抗原表达谱的研究：以改良Marshall(?)去成功制备直标抗体3A4-FITC。F/P比值为2.24,与理想比值(1-2)接近,滴定结果显示0.5μg 3A4-FITC直标抗体即可以饱和1×106KGla细胞。3A4抗原和CD45RA抗原(BD公司的CD45RA抗体识别的抗原,下同)在T-ALL的表达差异无统计学意义(P=0.313),3A4抗原在白血病细胞系的表达高于CD45RA抗原(P=0.045),3A4抗原在B系ALL和AML的表达明显高于CD45RA抗原,P值分别为0.009和0.000。3A4抗原在复发和耐药的白血病幼稚细胞上呈高表达,阳性率>90%,高于CD45RA抗原(P=0.016)。3A4抗原在白血病干细胞的表达呈强阳性,阳性率范围：83.33%-100%,中位值：97.83%。1.3 3A4抗体功能的研究：通过木瓜酶消化结合FCM检测发现,37℃孵育0.25h、0.5h、1h、2h、3h和4h,3A4的内化程度分别为5.31%、7.29%、36.91%、69.19%、72.64%和71.81%。4℃孵育抗体不内化。免疫毒素3A4-NCTD作用24h、48h、72h和96h,靶细胞死亡率分别为1.73%、15.27%、25.79%和61.09%。2基因工程抗体的制备及活性研究2.1 3A4重、轻链可变区基因的序列分析：VH3A4基因全长351bps, VL3A4基因全长321bps,分别编码117和107个氨基酸残基。互联网在线分析显示VH3A4含有4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)；VL3A4含有4个FR和3个CDR。2.2单链抗体ScFv3A4真核表达载体的构建和表达：ScFv3A4基因序列大小为763bp,将其插入真核表达载体pcDNA3.1,以重组载体转染CHO细胞,G418加压培养2周、4周和5周的阳性率分别为44.47%、97.80%和99.78%。竞争结合实验显示在5×105KGla细胞上,抗体相对亲和力为1.2×1010M-1。细胞免疫荧光染色显示转染细胞胞浆内有重组蛋白的表达。RT-PCR显示,以ScFv3A4CHO细胞cDNA为模板可扩增出目的基因条带。2.3嵌合型抗体Hm3A4真核表达载体的构建和表达：将ScFv3A4基因插入表达载体pHMCH3中。以重组载体转染CHO细胞,G418加压培养2周、4周的阳性率分别为96.51%和98.20%。平均荧光强度指数(Mean Fluorescence Intensity,MFI)分别为86.60和198.23。培养上清滴定实验显示：20μl上清可使1×106个KG1a细胞阳性率达到97.35%,MFI达到47.41,当上清量增至2ml时,MFI达到360.71。竞争结合实验显示在5x105KGl a细胞上,抗体相对亲和力为1.1×1011M-1。细胞免疫荧光染色显示转染细胞胞浆内有重组蛋白的表达。RT-PCR显示,以Hm3A4CHO细胞的cDNA为模板可扩增出目的基因条带。2.4人鼠嵌合型抗体Hm3A4的功能研究：Western-blot鉴定分子量,单体分子量约43 kDa,二聚体分子量约100 kDa。CDC实验发现Hm3A4对KGla细胞的CDC作用随浓度增高而增强,0.05μg/ml、0.1μg/mL、1μg/ml、5μg/ml的抗体对靶细胞的杀伤率分别为：18.4%、48.6%、70.1%、78.3%。Hm3A4通过ADCC作用对KGla的杀伤率达到28.96%。结论1.3A4单抗能够识别KG1a细胞表面的CD45RA抗原,其属于IgGlκ免疫球蛋白亚类。3A4抗体的重链和轻链分子量分别为57.9 kDa和30.3 kDa。2.3A4能够识别比CD45RA更多的B系ALL和AML白血病幼稚细胞,能够有效地识别髓系白血病干细胞和复发难治的白血病幼稚细胞。3A4和抗原结合后能够较快地内化至胞浆,其免疫毒素能够有效地靶向杀伤靶细胞。因此,3A4抗原可以成为靶向治疗的新靶点。3.成功构建3A4单链抗体真核表达载体pcDNA3.1/ScFv3A4和人鼠嵌合型抗体真核表达载体pHMCH3/Hm3A4;通过CHO细胞表达活性良好的单链抗体ScFv3A4和人鼠嵌合型抗体Hm3A4。