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背景骨骼肌缺损和功能障碍会对人体外形和运动系统造成严重影响。骨骼肌干细胞移植为肌肉疾病提供了新的治疗途径。卫星细胞(satellite cells,SCs)作为骨骼肌来源干细胞(skeletal muscle-derived stem cells,SMSCs)的一大亚群,存在于正常成人的骨骼肌膜和基底膜之间,表达特异性配对盒基因7(paired box 7,Pax7)和配对盒基因3(paired box 3,Pax3)。骨骼肌损伤断裂后,暴露的SCs被激活分化为成肌细胞;多个成熟的成肌细胞融合形成以肌管相连的肌纤维,修复局部肌肉缺损。但肌肉取材过程有创伤,供体存在疼痛、畸形等并发症限制了SMSCs移植的广泛运用。人眼轮匝肌(orbicularis oculi muscle,OOM)和躯体骨骼肌在肌纤维类型、功能代谢等方面存在明显差异。OOM作为重睑成形术后常见医疗废弃物,具有来源广泛、不违反医学伦理等优点。如果能从OOM分离培育出人眼轮匝肌来源骨骼肌干细胞(orbicularis oculi muscle-derived stem cells,OOMSCs),则有望在肌肉疾病的治疗中得到进一步运用。目的体外分离培养人OOMSCs,检测其细胞增殖能力,鉴定其多向分化潜能,特别是体内外肌肉再生修复能力。方法本研究的肌肉组织来自24名女性患者上睑成形术中切除的睑板前OOM。利用0.1%I型胶原酶消化分离大量有核细胞;经差速贴壁法多次接种得到OOMSCs。流式细胞仪鉴定细胞来源和增殖情况;体外诱导贴壁细胞鉴定其多向分化潜能。实时PCR(realtime-PCR,RT-PCR)在转录水平上定量分析OOMSCs成肌分化相关基因表达水平。设成肌诱导后的OOMSCs为实验组;未诱导OOMSCs为对照组。两组细胞分别注射到裸鼠胫前肌内,建立OOMSCs体内成肌分化模型;用CM-Di I染色技术体内示踪OOMSCs。移植1周后,取裸鼠胫前肌组织做组织学检测,观察肌纤维再生情况。结果利用0.1%酶消化OOM后,反复多次贴壁能获得Pax7、Pax3阳性表达的原代细胞。OOMSCs呈长梭形成纤维细胞样形态,阳性表达间充质干细胞和SCs特异表面抗原,在体外培养中能保持稳定的增殖能力。其成骨诱导后细胞外基质茜素红Alizarin red染色阳性;成脂诱导后OOMSCs内大量脂滴形成;成软骨诱导2周后软骨陷窝生成,细胞团块阳性表达Ⅱ型胶原蛋白。免疫荧光染色和RTPCR结果说明体外成肌诱导后的OOMSCs融合形成以肌管相接的新生肌纤维。成肌分化过程中,OOMSCs对Pax3、Pax7和成肌分化早中晚期特异性标志物成肌调节因子5(myogenicregulatory factor5,Myf5)、成肌分化因子(myogenic differentiation antigen,Myo D)显著表达。移植1周后,实验组存在CM-Di I标记的OOMSCs,胫前肌内有圆形嗜酸性的肌纤维结构形成;而对照组中无明显CM-Di I阳性细胞,胫前肌内出现大量单核细胞、浆细胞。淋巴细胞、多核巨细胞的炎性浸润周围出现成纤维细胞和细胞间质增殖,局部发生纤维化改变。结论人眼轮匝肌组织中含有OOMSCs,能用酶消化联合差速贴壁分离法进行体外分离。离体的OOMSCs增殖稳定,能向中胚层来源的成体细胞分化。OOMSCs具有较强的成肌分化能力;体内植入能建立有效的骨骼肌干细胞移植模型。体外成肌诱导的OOMSCs植入后能在体内实现肌肉再生,有望为肌肉疾病提供新的治疗方向。