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目的骨是高度血管化的组织,骨新生依赖良好的血供和营养支持,血管和骨细胞之间紧密的时空联系维持了骨骼的完整性。因此,在骨骼发展和骨折修复期间,血管形成起着相当重要的作用。同样,在传统输送盘牵张成骨过程中要求各骨段上要有充足的血液供应,以保证牵张过程中旺盛的代谢活动、超常的营养供应及各骨段组织的正常代谢。本课题基于一次应用传统的输送盘牵张成骨技术修复大范围颌骨缺损的临床实践中,意外发现完全剥离骨膜、无软组织附着的骨游离输送盘依然可以成功修复颌骨缺损的基础上,课题组负责人提出了“非血管化游离输送盘牵张成骨(Nonvascular Transport Distraction Osteogenesis,NTDO)”。之后课题组通过动物实验成功构建了“下颌骨非血管化骨游离输送盘牵张成骨”的动物模型,证实了剥离骨膜而失去血供的游离骨输送盘依然能在牵张引力作用下成骨。NTDO模式的提出打破了传统输送盘牵张成骨模式中必须强调术中要尽可能保存骨输送盘的骨膜和周围软组织附着来为输送盘提供充足血供的原则,NTDO为那些周围组织血供不足或由于巨大骨缺损而无法在骨断端制作保留骨膜和软组织附着的合适骨输送盘的患者提供了新的治疗方法。然而NTDO过程中血管新生的确切机制以及血管新生和新骨生成的时空耦联尚不明了,阐明NTDO过程中血管新生的机制,探索影响血管新生的细胞和分子机制,可以为NTDO提供理论依据,有助于指导临床更好地应用该技术。本研究应用血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)作为种子细胞,拟通过激活EPCs内的Notch信号转导通路,研究Notch信号转导通路在牵张区新生血管的系列分子调控事件,进一步阐明“非血管化游离输送盘牵张成骨”模式中的新生血管形成机制,为“非血管化游离输送盘牵张成骨”提供理论依据。“非血管化游离输送盘牵张成骨”技术将为临床广泛应用非血管化输送盘牵张成骨技术修复巨大骨缺损尤其是在无法实施传统的输送盘治疗整复的肿瘤术后重建及颅颌面整形等领域提供一种新的具有应用前景的治疗方法。方法1.犬内皮祖细胞(EPCs)体外分离培养及鉴定的实验研究:取健康杂种犬,年龄1~2岁,于双侧胫骨穿刺抽取胫骨骨髓20ml,采用密度梯度离心法结合特殊诱导培养基贴壁培养法分离培养犬骨髓内皮祖细胞;通过倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞表面标志物;通过免疫荧光双重染色鉴定及VEGFR-2与v WF免疫组化鉴定犬骨髓内皮祖细胞;通过Matrigel小管形成实验检测犬内皮祖细胞血管形成的能力。2.慢病毒介导的h Notch1.ICN转染犬EPCs的实验研究:构建Notch1.ICN慢病毒表达载体,测定病毒滴度,检测质粒表达情况;之后取犬第2代或者第3代EPCs,用慢病毒作为载体介导h Notch1.ICN基因转染入犬EPCs中,测定感染细胞最佳MOI;采用QPCR法和Western blot法检测慢病毒转染后h Notch1.ICN在EPCs的表达情况。3.过表达h Notch1.ICN对EPCs生物学行为的影响:采用CCK-8法检测过表达h Notch1.ICN对EPCs生长活力的影响;Annexin V/PI法检测过表达h Notch1.ICN对EPCs凋亡的影响;流式细胞仪检测过表达h Notch1.ICN对EPCs周期的影响;Transwell小室考察过表达h Notch1.ICN后EPCs跨内皮迁移的能力及对EPCs迁移粘附能力和血管形成能力的影响;QPCR法和Western blot法检测慢病毒转染EPCs后,Notch信号下游信号分子Hes 1和Hey 1的m RNA和蛋白表达情况。4.Notch信号通路促进非血管化输送盘牵张成骨血管新生的实验研究:取健康杂种犬27只随机分为3组,每组9只。A组:实验组(注射h Notch1.ICN基因转染的自体EPCs);B组:对照组(注射自体EPCs);C组:空白组(注射生理盐水)。建立犬下颌骨非血管化输送盘牵张动物模型,制作非血管化输送盘并安装牵张器。于牵张固定期1周、2周、4周后,各组分别处死相应动物并取材,通过大体观察、X线片观察新骨形成和改建情况;通过HE染色观察牵张区新生血管的结构;通过CD105免疫组织化学和Chalkley法来进行血管生成数量的定量检测;通过实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)、Western blot法检测牵张区血管生成因子VEGF-1和Ang-1 m RNA和蛋白表达情况。结果1.犬内皮祖细胞(EPCs)体外分离培养及鉴定的实验研究:原代培养5d后EPCs,镜下可见贴壁细胞体积开始增大,细胞呈集落式生长,细胞形态呈长条状、梭形或多角形,部分细胞形成集落,中心为多角形细胞,四周长梭形细胞呈放射状排列。培养至7-10d时传代后细胞生长、增殖速度较快,成群细胞呈典型的“铺路石”或“鹅卵石”样排列;流式细胞仪检测结果显示:CD34与CD133呈阳性表达;v WF与VEGFR-2免疫组化两者均呈阳性;免疫荧光双重染色结果显示EPCs既能摄取Di I-ac LDL又能与FITC-UEA-1结合是EPCs具有的典型内皮特征,提示该阳性细胞为正在向内皮细胞分化的EPCs;Matrigel小管形成实验结果显示EPCs具有形成新生血管的能力。2.慢病毒介导的h Notch1.ICN转染犬EPCs的实验研究:成功构建了Notch1.ICN慢病毒表达载体,犬内皮祖细胞感染慢病毒MOI值为10-20;通过Western Blot检测,h Notch l.ICN过表达慢病毒质粒在293TN细胞中有表达,病毒的平均滴度为1.02E+08 IU ml-1;QPCR法检测到慢病毒转染后h Notch1.ICN m RNA有明显过表达;通过Western Blot检测,h Notch l.ICN在EPCs中有明显过表达。3.过表达h Notch1.ICN对EPCs生物学行为的影响:CCK-8法检测过表达h Notch1.ICN基因对EPCs的生存活力没有显著影响(p﹥0.05);Annexin V/PI法检测过表达h Notch1.ICN基因可增强EPCs抗凋亡能力(p<0.05);流式细胞仪检测在EPCs过表达h Notch1.ICN基因使处于G2期的EPCs细胞增多(p<0.05);过表达h Notch1.ICN基因促进了EPCs与活化内皮细胞粘附,促进EPCs跨内皮迁移,促进EPCs管样结构形成(p<0.05)。q PCR和Western blot法检测慢病毒转染EPCs后结果显示,Notch信号下游信号分子Hes 1和Hey 1的m RNA(p<0.05)和蛋白表达均增加。4.Notch信号通路促进非血管化输送盘牵张成骨血管新生的机制实验研究:所有动物均顺利完成牵张,无感染,动物全部存活至取材时间,无死亡。实验动物的体重均有不同程度增加。放置于下颌部的牵张器均固定良好,无牵张区、牵张器断裂以及松脱现象。通过标本的大体病理、HE染色组织切片、X线,显示牵张区新骨均愈合良好,新骨形成质量由高到低:A组>B组>C组。通过Chalkley法定量检测新生血管的数量,在固定期1周、2周、4周,三组新生血管数量随着时间推移呈梯度递减趋势,新生血管数量A组到C组逐渐减少,各组经统计分析均有差异(p<0.05)。q PCR法检测Ang-1,在各时间点A组均显著高于B、C组(p<0.01);固定1周时,A组VEGF-A显著高于B组(p<0.01),2、4周时与B组比有统计学差异(p<0.05),A组均显著高于C组(p<0.01)。Western blot法检测VEGF-A、Ang-1蛋白表达A组>B组>C组,但随固定时间的延长,表达逐渐降低。结论1.过表达h Notch 1.ICN促进了Notch信号下游效应分子Hes 1、Hey1基因及蛋白的表达;持续活化的Notch 1信号不影响犬EPCs存活,但使细胞周期阻滞于G2期,延缓了细胞周期的进展,使其不进入下一轮细胞周期,抑制了EPCs的分化;增强了犬EPCs的抗凋亡能力。2.Notch 1.ICN过表达能够促进EPCs与活化内皮细胞的粘附、跨内皮迁移以及管腔样结构的形成。3.证实了Notch 1.ICN基因治疗是通过Notch信号上调血管生成因子VEGF-A与Ang-1的表达来促进非血管化输送盘牵张区血管的新生。