蛋白质衣壳对货源酶性质的影响

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纳米技术的重点是纳米级结构的设计。纳米材料在工业、生物医学和环境领域的应用越来越重要。生物纳米反应器是一种模拟自然区域化的纳米材料,区域化即细胞的各种生物分子通常都限制在一定的区域内,不同区域负责不同的功能,如细胞的能量代谢主要是发生在线粒体内,蛋白质的合成则在细胞质内进行;而区域化对于隔绝有毒的中间反应物、提高反应效率及防止不同反应的相互影响等方面都起到了重要的作用。病毒、铁蛋白、细菌微室和某些酶复合物等的外壳是带孔的蛋白壳(称为衣壳)组成,其作为纳米级容器进行化学反应的潜力引起了人们的极大兴趣。这种纳米反应器通常含有能催化所需转化反应的酶。酶可以通过共价或非共价作用与蛋白质外壳内部结合以将其装载于蛋白壳内。酶装载之后将会有被调节活性的可能性。因此,了解酶在蛋白质衣壳内的限制如何改变其催化活性是有潜在的理论和应用价值。而在封装酶的过程中,有几种可能影响酶活性的方法。首先,衣壳内部与封装蛋白质的相互作用可能会影响封装蛋白质的本征动力学参数;其次,底物进入活性部位的扩散或产品释放到散装溶液中的过程可能受到衣壳上通道的影响;第三,在有些情况中,多酶同时被包封在同一个载体中,特别是在底物浓度较低的情况下,增加中间产物的区域浓度,这样的系统有助于连续反应的进行;最后,在某些情况下,酶的包封会影响其稳定性。总之,包封在酶活性调节中的作用是非常复杂的。每种情况都可能经历一些不同的机制,最终的效果可能会有所不同。自然选择区域化来减少副产物的形成,提高反应速率。通过构建工程化纳米反应器,研究其产物的独特特性及其对反应动力学的影响,有助于我们更好地理解自然。在不同的纳米颗粒中,蛋白质衣壳是单分散的,对于研究有限空间内的酶反应具有潜在的应用价值。现有许多天然纳米反应器。据报道,存在于许多细菌和古细菌基因组中的封装蛋白(encapulin)可组装成T=3(180个亚单位,30-32nm)二十面体中空衣壳的T=1(60个亚单位,20-24nm)。其封装肽标记的发现非常有趣。其壳蛋白最初是1994年由透射电镜发现的。通过观察蛋白质的高分辨率结构,发现了蛋白质。通过对encapsulin胶囊的晶体结构的研究,对其封装机理有了初步的认识。研究发现,少量的额外电子密度与包裹蛋白外壳的内部结合,这也与包裹蛋白外壳基因旁的一个短的C端蛋白质序列相对应。生物信息学分析证实了该C末端序列在其他物种中也存在。生化证据表明,在组装过程中,通过肽标记与衣壳疏水囊袋之间的结合来装载包囊蛋白。在发现了这种称为货物装载肽(CLP)的肽标记后,对不同类型的包囊蛋白进行了鉴定。它们的大部分装载货物都是酶,在微生物的关键细胞过程中起着重要作用,如隔离毒性反应和作为特定的储存室。另一个著名的天然纳米反应器是细菌微复合物(BMC),它被认为是由酶核和选择性渗透蛋白壳组成的真核自组装细胞器,目的是限制气体底物,保护细胞免受有毒中间物的侵害,以及防止副反应。在这些BMC中,羧基体以其在卡尔文-本森-巴森循环中作为固定二氧化碳的重要作用而闻名。这种天然纳米反应器的形成是基于许多核心酶具有聚集和包含可与壳相互作用。工程纳米反应器常常利用病毒、细菌中发现的蛋白质外壳,以及通过计算技术设计的蛋白。豇豆绿斑驳病毒(CCMV)衣壳携带28纳米大小的RNA,已被很好地用来封装客蛋白。由于CCMV衣壳在pH7.5下可分解成90个二聚体,而在pH5.0下可形成衣壳,因此利用这一性质来封装辣根过氧化物酶(hrp),实验研究了衣壳携带的一种酶的活性,结果表明衣壳对底物和产物都具有渗透性。开发了另一种方法通过使用一个小的异二聚体卷曲线圈蛋白作为非共价锚,在CCMV衣壳中携带多个蛋白质,一个带正电荷的线圈连接到衣壳蛋白,另一个则连接到客蛋白。基于这种方法,使用CCMV衣壳携带多功能酶Pseudozyma lipase B(PalB)。该实验表明,包封的PalB比非包封的PalB更有效地转化底物,并显示了在衣壳的受限空间中进行级联反应的潜力。含RNA的噬菌体MS2衣壳是一个二十面体球体,由180个相同的蛋白质单体组成,平均直径为27纳米。它的单体可以独立表达,然后组装成病毒样的空衣壳,很容易去除大肠杆菌中的基因组RNA。MS2被设计成两个酶封装系统,通过在货运酶和改性MS2衣壳内表面形成共价结合,形成靛蓝生物合成途径。这导致体内靛蓝产量的增加,并与体外游离酶相比,提高了货运酶的长期稳定性。噬菌体Q与MS2相似,也是一种二十面体病毒样颗粒,由180个称为外壳蛋白的亚单位组成。菲德勒等将其RNA基因组中的发夹结构与CP内部残基之间的高亲和力相互作用特性应用于针对不同酶与发夹结构融合到噬菌体Q的衣壳中,最终表明该方法为利用脆弱或难纯化酶的活性提供了一种通用的方法。噬菌体P22通过定向自组装封装一种活性产氢和耐氧氢化酶。通过利用红外光谱特征描述新的生物反应器并测量其催化活性,发现封装的氢化酶比纯化的游离酶活性高出近100倍,并且P22衣壳确实保护其货物免受热量和蛋白质水解。铁蛋白存在于许多生命体中,是决定矿化铁的蛋白质外壳,比通常用于封装蛋白质和工程鲁马嗪合成酶变体的其他蛋白质容器小,其外径为12纳米,内径为8纳米。Stephan Tetter和Donald Hilvert利用古生菌的工程铁蛋白封装三种不同的酶,因为铁蛋白衣壳内部带负电荷,所以将带正电荷的绿色荧光蛋白拴在它们身上。他们表明,衣壳保持酶的催化活性,并对蛋白质水解和加热提供保护。在风产液菌和枯草芽孢杆菌中发现的2,4-二氧四氢喋啶合酶,都是16纳米宽、60个亚单位、十二面体的蛋白衣壳。它们成为了很有吸引力的生物纳米技术材料。风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶(AaLS)和枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶(BsLS)分别封装了同源核黄素合成酶,形成了天然的纳米反应器。2,4-二氧四氢喋啶合酶和核黄素合成酶分别是核黄素生物合成的最后两个步骤中的催化酶,承担催化反应的作用。风产液菌核黄素合成酶(AaRS)和枯草芽孢杆菌核黄素合成酶(BsRS)的碳末端肽可作为封装标记,可与其他蛋白质融合,以便在细胞内的合成期间将其他蛋白质引导到风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶和枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶衣壳的内部。尽管风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶和枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶总体上结构是相似的,并且约有50%的序列同源性,但它们之间仍旧存在一些重要的差异。例如,风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶更稳定,报告的熔化温度为120℃。枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶衣壳更具动态性,在缓冲液成分和酸碱度的某些轻微变化下,可以发生剧烈的膨胀。另外,风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶特异性地装载风产液菌核黄素合成酶,而枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶特异性地装载枯草芽孢杆菌核黄素合成酶;风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶不能与从枯草芽孢杆菌核黄素合成酶而来的碳末端肽标签结合。鉴于这些差异,比较这些同源衣壳如何影响普通货运酶的活性是很有趣的。在这项工作中,从嗜热脂肪土芽孢杆菌中选择一种被称为Est55的酯酶作为用来装载的模型酶。Est55是一种分子量为55kDa的单体酶,比自然条件下,被2,4-二氧四氢喋啶合酶相应装载的风产液菌核黄素合成酶或枯草芽孢杆菌核黄素合成酶(都是分子量为66kDa的三聚体)要小,因此Est55应该能够被装载进入风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶和枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶衣壳的内部。在这两种融合蛋白的生产过程里,风产液菌核黄素合成酶的最后12个氨基酸和枯草芽孢杆菌核黄素合成酶的最后11个氨基酸被添加到Est55的碳末端。这些Est55变种与相对应的合适的衣壳同时转化进入同一大肠杆菌细胞,在细菌内蛋白合成的过程中,2,4-二氧四氢喋啶合酶单体将进行自组装的时候,Est55变种便能透过相应肽标签与蛋白壳内部分子的结合作用被封装进入2,4-二氧四氢喋啶合酶蛋白壳中。风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶和枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶的负载率分别为0.16和0.39酯酶Est55分子。通过比较两个衣壳内的封装对Est55的米氏动力学参数的影响,发现对于风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶,封装的Est55的kcat和Km值相对于游离酶是基本不变;但有趣的是,在70℃温度环境下,风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶的封装可保护Est55两小时内不受不可逆变性的影响,而自由酶在20分钟内就丧失了 90%以上的活性。枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶的Est55封装与自由酶相比Kcat增加4.6倍,Km增加1.6倍;Est55可能在可控的条件下可以从枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶衣壳中释放出来,因为枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶:Est55封装复合物在pH 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中衣壳发生了膨胀的现象,同时酯酶活性降低了约90%。与枯草芽孢杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶相比,风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶的衣壳结构对缓冲条件的轻微变化没有显著变化。以前,人们发现风产液菌2,4-二氧四氢喋啶合酶的一个叫做AaLS-switch-pH的变体在将溶液pH从8.0更改为5.7时可以可逆地分解。如果利用有这种特性的AaLS-switch-pH装载目标蛋白,那么这个依赖于pH的拆卸开关可以控制目标蛋白的释放透过改变溶液环境。AaLS-switch-pH在壳内表面含有三个经突变得到的组氨酸,这三个组氨酸导致了组装状态中拥有pH依赖性变化的特性。然而,这些突变的残基可能改变衣壳与风产液菌核黄素合成酶衍生的封装标签的结合能力。本研究旨在探讨AaLS-switch-pH衣壳是否能以与野生型AaLS相似的方式装载客蛋白。AaLS-switch-pH 与融合了 AaRS 最后 12 个氨基酸的 GFP 共同生产,纯化后的 AaLS-switch-pH的荧光比纯化后的野生型AaLS少10倍。因此,AaLS-switch-pH的突变会干扰有效的衣壳装载。本研究旨在增进我们对2,4-二氧四氢喋啶合酶合成酶衣壳包裹酶的理解。AaRS衍生的封装标签将外源蛋白导入AaLS-switch-pH内部的能力受损表明了引入组氨酸的突变位置对与封装标签的结合可能有重要作用。虽然已经证实,将酶封装在蛋白衣壳中可以引起来宾酶的动力学参数的变化,但对于不同衣壳如何影响同一酶知之甚少。令人惊讶的是,Est55在同源AaLS和BsLS衣壳中的限制对酯酶的动力学参数有不同的影响,因为BsLS中的封装增加了酯酶的kcat值,而AaLS的封装不会改变kcat。这种差异的基础仍然不确定,但猜测可能是由于内衣壳表面会有局部静电环境的差异。BsLS衣壳以受控方式释放来宾酶的能力以及AaLS衣壳在高温下防止来宾酶不可逆变性的能力的增强表明,这些纳米反应器为活性调节提供了新的可能性。总之,这些发现可能有助于未来设计装载酶的纳米反应器。
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